1株拮抗禾谷鐮刀菌生防菌株的篩選鑒定

摘要：為有效預防由禾谷鐮刀菌引起的作物病害，提供生物防治新資源，篩選并鑒定可以有效抑制禾谷鐮刀菌的生防菌。采用稀釋平板法從小麥生境中分離菌株，以禾谷鐮刀菌為指示菌，利用平板對峙法篩選生防菌株，通過形態學觀察、菌株生理生化檢測以及16S rDNA、gyrB基因序列分析對生防菌株進行鑒定，并檢驗其對5種植物病原真菌的抑菌效果，測定其抑菌范圍。篩選出1株對禾谷鐮刀菌具有明顯抑菌作用的菌株B2-211022-01，抑菌率為5795%，其菌落形態、生理生化特征與芽孢桿菌相一致，通過序列同源性分析發現，該菌株的16S rDNA、gyrB基因序列與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）同源性最高，分別為99.9%、100.0%，系統進化樹構建結果顯示，菌株B2-211022-01與貝萊斯芽孢桿菌屬于一個分支，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌，該菌株除了能抑制禾谷鐮刀菌外，還對冬瓜枯萎病病菌、芍藥灰霉病病菌、番茄灰霉病病菌、牡丹炭疽病病菌、黃瓜枯萎病病菌等5種供試植物病原真菌表現出一定的抑制作用，抑菌范圍較廣，在農業生產中具有一定的病害防治潛力。

關鍵詞：禾谷鐮刀菌；生物防治；貝萊斯芽孢桿菌；抑菌作用；生防菌株

中圖分類號：S432.4+4；S182文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0128-06

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是一種主要侵染小麥、玉米等禾本科作物的病原真菌，由其引起的病害在全球范圍內廣泛存在，感染作物后產生的真菌毒素不僅損害作物的產量和品質，還會引發糧食安全問題，給人畜健康造成嚴重威脅［1-2］。近年來，受氣候、秸稈還田等影響，一些由禾谷鐮刀菌引起的病害，如小麥赤霉病在我國愈發嚴重，且呈從南方逐步向北方擴散的態勢［3］。目前，針對這種病害的防治主要依賴于化學農藥。然而，長期使用化學農藥會導致環境污染、農藥殘留以及耐藥菌的出現等問題［4-6］。因此，尋求一種可持續的、環境友好的控制方案是未來發展的方向。生物防治作為一種安全、環境友好、效果明顯的防治手段，在綠色農業發展方面愈發受到重視，其中開發新型天然拮抗微生物是生物防治的有效途徑，對保障糧食安全具有重要意義。

筆者所在課題組調查發現，在內蒙古赤峰市小麥種植基地，未施用農藥的部分農田出現小麥赤霉病害，而與之相鄰田塊的植株并未發病且長勢良好，推測在該地區未發病作物生長環境中可能存在抑制禾谷鐮刀菌的生防菌株。因此，本研究從未施用農藥且長勢良好的小麥生境中進行取樣，通過稀釋平板法分離篩選對禾谷鐮刀菌具有較強拮抗作用的生防菌株，利用形態學、生理學以及分子生物學方法對篩選出的菌株進行鑒定，并初步探究其抑菌廣譜性，以期為由禾谷鐮刀菌等引起的真菌病害提供新的生防資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

發病植株、未發病植株及根際土壤樣品于2021年5—6月采集自內蒙古赤峰市松山區小麥種植基地。供試菌株為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）、牡丹炭疽病病菌（Gloeosporium sp.）、芍藥灰霉病病菌（Botrytis paeoniae）、番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea）、冬瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum f. sp. benincasae），均由赤峰學院微生物實驗室分離保藏，經活化后備用。所用培養基為營養肉湯（NB）培養基、馬鈴薯瓊脂（PDA）培養基、胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基均購于青島海博生物技術有限公司。后續試驗（2021年9月至2022年12月）在赤峰學院化學與生命科學學院微生物實驗室進行。

1.1.2 試驗儀器

恒溫培養箱（SHP-1500型，金壇市金祥龍電子公司）、超凈工作臺（VS-1300L-U型，蘇州安泰空氣技術有限公司）、生物顯微鏡（BX53F型，OLYMPUS公司）、高壓滅菌器（HVE-50型，HIRAYAMA公司）、電子天平（BSA224型，賽多利斯科學儀器公司）、搖床恒溫培養箱（LYZ-2102C型，上海龍躍儀器設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離

采用稀釋平板法［7］分離菌株，具體操作步驟：將在小麥赤霉病發生期間采集的發病植株、未發病植株及根際土壤樣品分別置于三角瓶中，加入9倍質量的無菌水，于25 ℃、150 r/min條件下振蕩30 min，取上清液，加入無菌水進行稀釋，配制成不同濃度的稀釋液，取100 μL稀釋液涂布于TSA培養基上，在28 ℃條件下避光培養24 h后，挑選形態差異顯著的菌落進行分離、純化和培養，4 ℃保存備用。

1.2.2 生防菌的篩選

采用平板對峙法［8］篩選生防菌株，具體操作步驟：將分離得到的單菌落于 28 ℃、180 r/min條件下在NB培養基中振蕩培養 12 h，使菌液在600 nm波長下的吸光度（D600 nm）為10，得生防菌液。在培養5 d的禾谷鐮刀菌菌落邊緣挑取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板培養基中央位置，以菌餅為中心，在距離菌餅3 cm處點接 1 μL 生防菌液，以無菌水為對照，在28 ℃條件下培養4 d后，采用十字交叉法測量各菌落直徑，計算抑菌率。

1.2.3 菌體形態特征觀察

選取拮抗禾谷鐮刀菌效果最好的菌株，在TSA培養基上純化后，放置在28 ℃生化培養箱中培養48 h，觀察菌落形態。對純化的菌株進行革蘭氏染色，然后在光學顯微鏡下觀察菌株形態。

1.2.4 生理生化測定

參照《常見細菌系統鑒定手冊》［9］測定生防菌株的生理生化指標。

1.2.5 分子生物學鑒定

取純化后的菌株樣品，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rDNA、gyrB基因序列測定，在NCBI數據庫中進行BLAST同源序列比對，并在MEGA 11.0軟件中采用鄰接法［10］進行系統進化樹構建。

1.2.6 生長曲線的繪制

將生防效果最好的菌株B2-211022-01按1％的接種量接種于NB液體培養基中，在28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養36 h，每3 h檢測1次樣品的D600 nm，以時間為橫坐標、D600 nm為縱坐標，繪制B2-211022-01菌株的生長曲線。

1.2.7 對5種植物病原真菌的拮抗作用

將B2-211022-01菌株接入NB培養基中培養12 h后，采用平板對峙法對除禾谷鐮刀菌外的其他5種植物病原真菌進行抑菌效果測定，以評價其抑菌范圍，測定方法同“1.2.2”節。

1.2.8 數據處理

數據處理使用Excel 2019和DPS 15.10軟件，采用Duncan’s新復極差法在0.05水平上進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 生防菌分離篩選及拮抗效果

通過分離得到47株菌株，將其分別編號為 B2-211022-01～B2-211022-47，以禾谷鐮刀菌為指示菌，篩選出有較強拮抗作用的菌株2株（B2-211022-01和B2-211022-05），其中菌株B2-211022-01的抑菌效果最好，抑菌率為57.95%（圖1）。

2.2 形態學觀察及生理生化指標測定

將B2-211022-01菌株于28 ℃條件下在TSA培養基上培養48 h后，進行形態觀察，結果（圖2）顯示，該菌菌落近圓形，邊緣不規則，顏色淺黃，不透明，表面濕潤。在光學顯微鏡下觀察發現，菌體呈桿狀，大小為（0.6～0.8） μm×（1.9～2.8） μm，單個或成對排列，柱形芽孢，近端生，胞囊不膨大，革蘭氏陽性。這一形態特征與芽孢桿菌一致，因此鑒定B2-211022-01為芽孢桿菌。

生理生化鑒定結果（表1）表明，該菌可水解七葉苷，利用肌醇、D-甘露糖、D-葡萄糖、糖原、D-甘露醇、D-核糖、D-海藻糖；不能利用麥芽三糖、D-松三糖、D-半乳糖等；具有β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳氨酶、ɑ-半乳糖苷酶、甘氨酸芳氨酶、α-葡萄糖苷酶、丙氨酸芳氨酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳氨酶等活性；丙酮酸鹽反應、紅四氮唑試驗呈陽性；在6.5%氯化鈉溶液中可以生長，對卡那霉素、多黏菌素B敏感，而對竹桃霉素具有抗性。這與文獻［11-13］中對貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）生理生化特性的描述基本一致，依據《常見細菌系統鑒定手冊》［9］，結合菌株形態特征，初步鑒定B2-211022-01菌株為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。

2.3 分子生物學鑒定

以供試菌株B2-211022-01的基因組DNA為模板，分別擴增其16S rDNA、gyrB基因片段，獲得長度分別為1 396、1 098 bp的序列，通過在NCBI數據庫中進行BLAST同源序列比對發現，這2個序列與貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）對應序列的同源性分別為99.9%、100.0%。通過構建的系統發育樹可以看出，菌株B2-211022-01的16S rDNA、gyrB序列與貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）聚于一支（圖3）。因此，進一步確定菌株B2-211022-01為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。

2.4 菌株B2-211022-01生長曲線測定

為進一步了解菌株的生長特性，對菌株B2-211022-01的生長曲線進行測定，結果（圖4）表明，B2-211022-01菌株的生長遲緩期相對較短，其對數期為培養6～12 h， 培養15～27 h為穩定生長期且持續時間較長，27 h后進入衰退期。因此，采用培養12 h的菌液進行抑菌試驗。

2.5 菌株B2-211022-01對5種植物病原菌的拮抗作用

為檢測菌株B2-211022-01的抑菌廣譜性，以5種植物病原菌為供試菌，進行抑菌效果檢測，結果（表2、圖5）表明，菌株B2-211022-01對5種植物病原真菌均有較好的抑制作用，尤其對番茄灰霉病病菌抑制效果最明顯，抑菌率達到68.85%，而對芍藥灰霉病病菌的抑制作用相對較弱，抑菌率為30.01%。

3 結論與討論

本研究從小麥生境中分離純化得到1株對禾谷鐮刀菌有明顯拮抗作用的生防菌株B2-211022-01，該菌株的形態特征以及生理生化特性與芽孢桿菌相一致，菌株的16S rDNA、gyrB基因序列與貝萊斯芽孢桿菌同源性最高，分別為99.9%、100.0%，系統發育樹構建結果顯示，菌株B2-211022-01與貝萊斯芽孢桿菌屬于一個分支，因此，綜合3個方面的結果，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）。

近年來，有研究者利用生防菌防治由禾谷鐮刀菌引起的植物病害，其中應用較為廣泛的菌株為芽孢桿菌和假單胞桿菌，木霉、酵母和其他細菌也有一定防治效果［14］。如李艷情等發現，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）及其活性代謝產物脂肽類化合物對由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病有強烈的抑制作用［15］。張強等從河南地區蔬菜大棚采集的土樣中分離純化出1株鏈霉菌，該菌的孢子能抑制禾谷鐮刀菌的生長［2］。亓文哲等發現，死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）TA-1能抑制禾谷鐮刀菌菌絲的生長［16］。Sun等發現，桿菌霉素D對受污染的小麥中禾谷鐮刀菌生長能起到明顯抑制作用，抑制率可達94.6%［17］。楊楠從小麥生境中分離篩選得到1株綠針假單胞菌PC60，發現其對禾谷鐮刀菌有強烈的抑制作用［14］。孫露發現，從土壤中篩選的特基拉芽孢桿菌WRN032對禾谷鐮刀菌具有一定的抑制作用［18］。本研究所篩選出的貝萊斯芽孢桿菌B2-211022-01在試驗條件下對禾谷鐮刀菌有良好的拮抗效果，抑菌率為57.95%，可作為一種抑制禾谷鐮刀菌的生防菌資源。

作為在自然界中普遍存在的一種芽孢桿菌，貝萊斯芽孢桿菌在1999年被首次分離，2005年得以被命名和報道，其分布范圍涵蓋了植物組織、河水、土壤和海洋等多種環境［19］。目前，對于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在抗菌物質、誘導植物系統抗性、拮抗病原菌及其機制等方面［20-21］。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌不僅可以分泌多種廣譜抗菌的次級代謝產物［22-23］，還具有提高植物抗性［24］、促進植物生長［25］等作用。目前一些菌株已經應用于甜櫻桃軟腐病［26］、花生莖腐病［27］等植物病害的防治工作中。本研究分離鑒定的菌株B2-211022-01對禾谷鐮刀菌具有較強的拮抗作用，同時平板對峙試驗結果表明，該菌株對冬瓜枯萎病病菌、黃瓜枯萎病病菌、番茄灰霉病病菌、牡丹炭疽病病菌等5種植物病原真菌也具有抑制效果，說明該菌株抑菌譜較廣，在開發新型的復合生物拮抗劑方面具有一定的應用潛力。

參考文獻：

［1］韓雪勤，杜凱月，李清怡，等. 禾谷鐮刀菌內吞蛋白FgSyp1的功能研究［J］. 植物病理學報，2023，53（2）：207-216.

［2］張 強，張艷茹，霍云鳳，等. 禾谷鐮刀菌拮抗菌21-6的鑒定及其抑菌活性測定［J］. 微生物學通報，2022，49（10）：4144-4157.

［3］張艷茹，霍云鳳，石紅利，等. 禾谷鐮刀菌拮抗菌ZQT-9的鑒定與抑菌活性［J］. 江蘇農業科學，2021，49（18）：111-115.

［4］胡元森，朱明杰，宇光海，等. 一株禾谷鐮刀菌拮抗菌株的篩選及鑒定［J］. 南方農業學報，2013，44（2）：234-239.

［5］曹 翠，宋瑞清. 植物病害生物防治菌的篩選［J］. 首都師范大學學報（自然科學版），2019，40（5）：43-51.

［6］宗 英，趙月菊，劉 陽，等. 一株貝萊斯芽孢桿菌抑制禾谷鐮刀菌的研究［J］. 核農學報，2018，32（2）：310-317.

［7］孫 科，耿鳳英，于秋菊，等. 牛蒡根際土壤中解鉀菌篩選、鑒定及解鉀條件優化［J］. 中國釀造，2020，39（10）：103-108.

［8］葉 瑩，霍 達，張曉陽，等. 一株拮抗芋頭干腐病的貝萊斯芽孢桿菌的篩選與鑒定［J］. 江西農業大學學報，2022，44（2）：368-376.

［9］東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊［M］. 北京：科學出版社，2001.

［10］崔艷紅，李 玲，白 倩，等. 板栗Hsp90基因家族的鑒定及在胚珠發育過程中的表達分析［J］. 北京林業大學學報，2022，44（11）：10-19.

［11］Ruiz-García C，Béjar V，Martínez-Checa F，et al. Bacillus velezensis sp.nov.，a surfactant-producing bacterium isolated from the river Vélez in Málaga，southern Spain［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2005，55（1）：191-195.

［12］王青華，孫曉暉，唐 旭，等. 深海貝萊斯芽孢桿菌DH82的篩選、鑒定及其抗菌粗蛋白性質分析［J］. 海洋通報，2019，38（1）：63-69.

［13］郭藝偉，劉依山，包永占，等. 蚯蚓源貝萊斯芽孢桿菌Y1鑒定及生物學特性研究［J］. 中國獸醫雜志，2022，58（4）：24-29.

［14］楊 楠. 生防菌株PC60對小麥赤霉病的生物防治機理研究［D］. 杭州：浙江大學，2017.

［15］李艷情，翟煥趁，薛曉雯，等. 小麥赤霉病菌拮抗菌的篩選及拮抗特性研究［J］. 南方農業學報，2022，53（11）：3118-3127.

［16］亓文哲.死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）TA-1對禾谷鐮刀菌的抑菌機理及其基因組序列分析［D］. 泰安：山東農業大學，2019.

［17］Sun J，Li W，Liu Y N，et al. Growth inhibition of Fusarium graminearum and reduction of deoxynivalenol production in wheat grain by bacillomycin D［J］. Journal of Stored Products Research，2018，75：21-28.

［18］孫 露. 植物真菌病生防菌的篩選和發酵優化及活性成分分離研究［D］. 天津：天津大學，2020：11-26.

［19］李永麗，周 洲，尹新明.貝萊斯芽孢桿菌Mr12預防蘋果輪紋病等病害的潛力及其全基因組分析［J］. 果樹學報，2021，38（9）：1459-1467.

［20］張德鋒，高艷俠，王亞軍，等. 貝萊斯芽孢桿菌的分類、拮抗功能及其應用研究進展［J］. 微生物學通報，2020，47（11）：3634-3649.

［21］李 錚，王金輝，丁麗麗，等. 貝萊斯芽孢桿菌菌株NZ-4生防潛能及基因組學分析［J］. 江蘇農業科學，2023，51（2）：117-125.

［22］Han V C，Yu N H，Yoon H，et al. Identification，characterization，and efficacy evaluation of Bacillus velezensis for shot-hole disease biocontrol in flowering cherry［J］. The Plant Pathology Journal，2022，38（2）：115-130.

［23］張德鋒，高艷俠，可小麗，等. 貝萊斯芽孢桿菌LF01基因組序列分析及其代謝產物的生防作用［J］. 水產學報，2022，46（2）：196-206.

［24］Rashid M H O，Khan A，Hossain M T，et al. Induction of systemic resistance against aphids by endophytic Bacillus velezensis YC7010 via expressing PHYTOALEXIN DEFICIENT4 in Arabidopsis［J］. Frontiers in Plant Science，2017，8：211.

［25］Meng Q X，Jiang H，Hao J J.Effects of Bacillus velezensis strain BAC03 in promoting plant growth［J］. Biological Control，2016，98：18-26.

［26］郗良卿，吳 澎，李睿琪. 貝萊斯芽孢桿菌對甜櫻桃軟腐病生防效果的研究［J］. 中國果菜，2022，42（1）：59-68.

［27］Jia S，Song C，Dong H，et al. Evaluation of efficacy and mechanism of Bacillus velezensis CB13 for controlling peanut stem rot caused by Sclerotium rolfsii［J］. Frontiers in Microbiology，2023，14：1111965.