水稻phyC突變體葉綠素合成及光合熒光特性的研究

摘要：光敏色素是植物的重要感光器之一，在光形態建成過程中起重要作用，同時也參與調控葉綠素的合成。江蘇省農業科學院利用CRISPR/Cas9技術敲除了南粳46中的PHYC，發現突變體抽穗期提前，而且相較于南粳46，其千粒重增加，但對其光合特性沒有過多闡述。本研究以南粳46phyC突變體（phyC）與南粳46野生型（WT）為材料，利用光合儀、熒光儀分別測定2種水稻材料的光合參數、葉綠素熒光參數；測定水稻葉片的葉綠素含量、葉綠素合成前體物質含量，并進一步分析2種水稻材料中葉綠素合成相關基因的表達情況，以期對突變體的光合生理性能進行初步探究。結果表明，和WT相比，突變體phyC的葉綠素含量在孕穗期、齊穗期明顯增加，但在灌漿期卻顯著下降；突變體phyC葉片葉綠素合成代謝中間產物5-氨基乙酰丙酸（ALA）、膽色素原（PBG）、尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）、原卟啉Ⅸ（Proto Ⅸ）、鎂原卟啉Ⅸ（Mg-Proto Ⅸ）、原脫植基葉綠素（Pchlide）的含量均顯著高于WT；在光合參數方面，phyC的凈光合速率在孕穗期、齊穗期高于WT，在灌漿期低于WT；phyC的單位反應中心吸收的光能（ABS/RC）、耗散的光能（DIo/RC）、捕獲的光能（TRo/RC）、PSⅠ端還原電子的效率（REo/RC）、綜合性能指數（以吸收為基礎）（PIabs）在孕穗期、齊穗期均高于WT，而在灌漿期均低于WT；此外，phyC的葉綠素合成與降解相關基因的表達水平在3個生育期都有所上調。這表明敲除PHYC可以使得葉綠素合成及降解基因的表達量提高，從而使得在孕穗期和齊穗期葉綠素含量提高，熒光參數提高，最終導致光合速率提高。在灌漿期，phyC葉綠素的生物合成可能是在原脫植基葉綠素到葉綠素a的合成過程中受到阻抑，該過程需要光的參與，可能是由于PHYC的敲除使得在這個時期phyC對光照的吸收與利用能力有所下降。

關鍵詞：水稻；phyC突變體；葉綠素合成；葉綠素熒光；光合速率

中圖分類號：S511.01文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0080-08

高等植物利用光進行光合作用以獲取能量，同時光也是一種重要的環境信號，對植物的生長和發育過程起著關鍵作用。植物有多種感光器系統，包括光敏色素、隱色素、光促素、黃素蛋白、抗紫外線位點8（UVR8）［1-5］，通過這些感光器系統，植物可以感知不同光質、光強、光周期等條件的變化，并隨時調整其生長和發育。其中，光敏色素作為植物的感光蛋白之一，主要對紅光、遠紅光做出反應；光敏色素在調控植物生命周期中扮演著關鍵角色，參與多個重要發育過程的調節［6-7］。水稻光敏色素基因家族由PHYA、PHYB、PHYC這3個成員組成。光敏色素分子有2種穩定的可以相互轉化的二聚體形式，即紅光吸收形式（Pr）、遠紅光吸收形式（Pfr），Pr是不具有生物活性的［8］。紅光可以誘導Pr向Pfr構象轉變，促進Pfr轉位到細胞核，細胞核中的光敏色素可與不同蛋白質相互作用，通過不同途經調控基因的表達［1，8-9］。在水稻植株中，光敏色素C主要以phyB/phyC異二聚體的形式存在，而單體的形式則少得多，在水稻中尚未觀察到phyC的同型二聚體形式［10］。

近年來，關于光敏色素的研究已經取得了相當大的進展。已有研究表明，光敏色素參與調節葉綠素的合成。例如谷氨酰tRNA還原酶是生成5-氨基乙酰丙酸（ALA）的關鍵酶，研究發現編碼谷氨酰tRNA還原酶的基因HEMA的表達可由AtPHYA、AtPHYB、cry1、cry2共同調節，從而影響葉綠素的合成［11］。光敏色素B可以通過轉錄調控分別編碼H亞基、鎂螯合酶（MG-螯合酶）的激活因子ChlH、GUN4，進而介導水稻幼苗葉綠素的生物合成［12］；趙杰等發現光敏色素B能夠正調控葉綠素合成中關鍵酶基因PORA的表達，來正調控水稻葉綠素的合成，并且影響葉綠體的發育［13］。Li等對PHYB（C364A）/aabb株系進行功能驗證和表型分析，發現與aabb突變體相比，PHYB（C364A）/aabb株系的幼苗葉綠素含量較高，推測PHYC可能正向調控水稻幼苗生長過程中的葉綠素合成［14］。

目前對于PHYA、PHYB功能的分析研究甚多；但由于水稻中PHYC的功能依賴于PHYB蛋白，因此單獨描述PHYC的功能較困難，對PHYC的研究相對較少。在擬南芥中，PHYC等位基因在調節開花和生長反應的自然變異中發揮重要作用［15］。此外，在長日照光周期誘導下，PHYC在決定大麥、小麥的抽穗時間中起著重要作用［16-17］。因此，研究PHYC在水稻生長發育中的作用有重要意義。Li等利用CRISPR/Cas9基因編輯系統敲除南粳46中的PHYC，產生功能缺失的phyC突變體，發現敲除PHYC可適度縮短南粳46的抽穗期并增加千粒重［18］。水稻的產量與其光合效率有很大關系，光合效率高是作物高產的前提條件。影響光合作用的因素也有很多，葉綠素是吸收并利用光能的一個重要因素，葉綠素與光敏色素之間的聯系已被發現。本研究通過比較水稻phyC突變體與野生型南粳46，來進一步探究phyC突變體的葉綠素合成以及光合熒光特性的變化，以期對PHYC在水稻中的功能有更深入的了解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與采樣

材料：江蘇省農業科學院培育的水稻品種南粳46野生型（WT）、南粳46 phyC突變體（phyC）。試驗于2022年在江蘇省南京市南京師范大學仙林校區植物園內（32°03′N，118°47′E）進行。試驗田前作空閑，土壤為黏土，肥力中等，土壤全氮含量為 1.06 g/kg。2個水稻品種于2022年5月4日育秧，5月28日插秧，2個品種各種植3個重復的小區，每個小區設3行×12列，株行距為20 cm×20 cm。按照當地水稻常規方式進行澆灌和施肥管理。于8月9日（phyC孕穗期）、15日（WT孕穗期、phyC齊穗期）、29日（WT齊穗期），9月1日（phyC灌漿期）、10日（WT灌漿期）10：00分別取樣（劍葉），并測定光合參數、熒光參數。葉片取下后放入液氮中，帶回實驗室保存在-80 ℃冰箱。每項試驗均至少進行3次獨立的生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 光合色素含量的測定

根據Arnon等的方法［19］，測定phyC、WT在3個時期的光合色素含量。首先，用天平稱取0.1 g保存于冰箱的葉片，將其剪碎，然后放入15 mL的離心管中。加入10 mL提前配好的提取液（含丙酮45%、乙醇45%、水10%），旋緊蓋子后渦旋振蕩，確保葉片完全浸泡其中。將其避光放置16～18 h。在此期間，可經常上下顛倒離心管，確保充分提取色素。觀察到葉片變白時，表示色素已完全溶于提取液中。然后取出部分提取液，3 000 g離心5 min，取上清液。使用紫外分光光度計測量上清液在470、645、663 nm處的吸光度。樣品進行3次生物學重復。根據公式計算光合色素含量，并將其換算表示成每克鮮重含量。計算公式為：

葉綠素a（Chla）含量（mg/g）=12.7×D663 nm-2.69×D645 nm；

葉綠素b（Chlb）含量（mg/g）=22.9×D645 nm-468×D663 nm；

類胡蘿卜素（Car）含量（mg/g）=（1 000×D470 nm-327×Chla-104×Chlb）/229。

1.2.2 葉綠素合成代謝中間產物測定

1.2.2.1 δ-氨基乙酰丙酸（ALA）的測定

根據Dei等的方法［20］對3個時期的葉片的ALA含量進行測定。稱取0.2 g葉片，用液氮研磨成粉末，加入2.5 mL的4%三氯乙酸充分研磨成勻漿，將勻漿液用三氯乙酸定容至8 mL，倒入離心管中。用高速離心機18 000 g離心15 min，棄去沉淀，取1 mL上清液，分別加入0.5 mL乙酸鈉（1 mol/L）和50 μL 100%乙酰丙酮，放入100 ℃水浴鍋中10 min。取 1 mL 冷卻后的樣液加入等體積的Ehrlich-Hg試劑進行顯色，暗處理15 min后，用紫外分光光度計測定D553 nm。ALA含量以553 nm的摩爾消光系數 7.2×104/（mol·cm）計算。

1.2.2.2 膽色素原（PBG）的測定

根據Bogorad的方法［21］測定PBG的含量。提前配制提取緩沖液（配方為0.6 mol/L Tris，0.1 mol/L EDTA，調pH值至8.2），稱取0.2 g葉片，用液氮研磨成粉末，加入2 mL提取緩沖液研磨成勻漿， 18 000 g 離心 10 min，棄沉淀。取1.5 mL上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg試劑，暗處理15 min使其顯色，用紫外分光光度計測定D553 nm，PBG含量以553 nm的摩爾消光系數6.1×104/（mol·cm）計算。

1.2.2.3 尿卟啉原Ⅲ（Urogen Ⅲ）的測定

根據Bogorad的方法［21］進行測定。提前配制 0.067 mol/L、pH值為6.8的PBS緩沖液，稱取 0.2 g 葉片，用液氮研磨成粉末，加入10 mL PBS研磨成勻漿，在12 000 g下離心10 min。取3 mL上清液加入0.15 mL 1%的硫代硫酸鈉，渦旋振蕩，再將燒杯放在強光下照射20 min。加入1 mol/L冰乙酸，調其pH值至3.5。最后用4 mL 100%乙醚進行3次萃取，取出最后的水相，測定D405.5 nm。Urogen Ⅲ含量以405.5 nm的摩爾消光系數5.48×105/（mol·cm） 計算。

1.2.2.4 原卟啉Ⅸ（Proto Ⅸ）、鎂原卟啉Ⅸ（Mg-Proto Ⅸ）和原脫植基葉綠素（Pchlide）的測定

根據Hodgins等的方法［22］，稍加改動后進行測定。稱取0.2 g劍葉，加10 mL 80%堿性丙酮研磨成漿，將渾濁物在冰上沉淀30 min，然后將提取物在離心機中離心10 min以澄清上清液。吸取上清液，分別在波長575、590、628 nm處測吸光度，吸光值在上述波長下相對于80％丙酮空白進行讀數。通過如下公式對其含量進行計算：

ProtoⅨ=0.180 16×D575 nm-0.040 36×D628 nm-0.045 15×D590 nm；

Mg-ProtoⅨ=0.060 77×D590 nm-0.019 37×D575 nm-0.003 423×D628 nm；

Pchlide=0.035 63×D628 nm +0.007 225×D590 nm-0.003 423×D628 nm。

1.2.3 光合參數測定

根據Xia等的方法［23］，使用 LI-6400便攜式光合測定儀（LI-6400，LI-COR，Lincoln，woNebraska USA）的紅藍光源，測定植株的光合參數。于晴天08：00—10：00，溫度為28～33 ℃，選取生長狀態基本一致的劍葉，室外環境下使用光合儀的內置光源［1 000 μmol/（m2·s）PPED）］，測定phyC突變體、WT在孕穗期、齊穗期、灌漿期的凈光合速率［μmol/（m2·s）］、蒸騰速率［mmol/（m2·s）］、胞間CO2濃度（μmol/mol）、氣孔導度［mol/（m2·s）］。每個小區測定6～7張葉片，每張葉片測定3次。

1.2.4 葉綠素熒光參數測定

依照Strasser等的方法［24］，采用Handy PEA連續激發式熒光儀（Hansatech，UK）分別測定phyC突變體、WT在孕穗期、抽穗期、灌漿期的熒光參數。每個小區選取10張長勢基本一致的葉片，用夾子夾在葉片2/3處，推上蓋片。暗處理20～25 min后，拉開蓋片，測量葉片的瞬時熒光參數，共重復測量3次。數據采用軟件PEA Plus、Origin 2018進行分析處理。

1.2.5 熒光定量PCR

1.2.5.1 總RNA的提取

（1）取-80 ℃保存的材料放入研缽中，加入液氮研磨成粉末刮至2 mL EP管中（粉末超過管底即可），加入1 mL Trizol充分振蕩，室溫下靜置5 min；（2）4 ℃、12 000 g離心 5 min，取上清液于新的EP管中；加入200 μL預冷的CHCl3，輕輕顛倒晃動，冰上靜置3 min；（3）4 ℃、12 000 g離心15 min，分成3層（上、中、下層分別是RNA、蛋白質、DNA）；（4）取上層清液 450 μL，加入等體積預冷的100%異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃靜置30 min；（5）4 ℃、12 000 g離心10 min，留沉淀；（6）75%乙醇洗沉淀，輕輕顛倒，4 ℃、7 500 g離心5 min，留沉淀（盡量去除乙醇），再用乙醇洗滌2次，室溫晾干；（7）加入30 μL DEPC水懸浮溶解沉淀，質檢、測濃度后-80 ℃冰箱保存。

1.2.5.2 RNA逆轉錄

按照逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）的方法進行反轉錄試驗：（1）在離心管中配制如下體系：4 μL 4×gDNA wiper Mix，1 μL RNA，加 ddH2O至16 μL；（2）渦旋離心后置于PCR儀，42 ℃ 2 min；（3）加入4 μL 5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix；（4）渦旋離心后置于PCR儀，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s進行逆轉錄反應。

1.2.5.3 qRT-PCR

按照試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）的方法進行定量PCR試驗。反應體系為5 μL 2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，0.2 μL Primer 1和Primer 2 （10 μmol/L），1 μL cDNA以及ddH2O（至10 μL）。將加好樣的96孔板在 4 000 g 4 ℃條件下離心3 min，置于熒光定量PCR儀中，按如下程序進行q-PCR反應：（1）預變性：95 ℃，5 min；（2）循環反應：96 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環40次；（3）熔解曲線：96 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，96 ℃ 15 s。基因表達量以內參基因Actin為標準，以WT為對照，利用2-ΔΔCT法計算目的基因的mRNA表達量。

1.2.5.4 引物設計 表1為本研究所用到的熒光定量PCR引物。

2 結果與分析

2.1 葉綠素及其前體含量差異分析

葉綠素a、葉綠素b都是高等植物吸收和傳遞光能的主要色素，主要吸收紅光和藍紫光。部分葉綠素a還作為反應中心色素，葉綠素a和葉綠素b相互作用，共同調節植物的光合速率。葉綠素含量與葉綠素a含量/葉綠素b含量呈負相關；葉綠素含量高，葉綠素a含量/葉綠素b含量較低，光合作用速率高，該比值是影響光合作用速率的重要內因。而葉綠素合成途經是一個非常復雜的過程，其前體合成過程中任何一步受到影響，都會影響最終葉綠素的含量。由圖1-A、圖1-B、圖1-D可知，在孕穗期、齊穗期，phyC的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量顯著高于WT，但在灌漿期明顯下降，分別下降了12.32%、15.79%、1872%。說明在孕穗期和齊穗期，phyC吸收紅光的能力增強，在灌漿期減弱。由圖1-C可知，在孕穗期、齊穗期，與WT相比，phyC的Chla/Chlb沒有明顯變化，但是在灌漿期，phyC的Chla/Chlb顯著高于WT，這說明在灌漿期phyC的光合速率有可能低于WT。在圖1-E中，為了更直觀地進行比較，以WT的各物質含量為100%來表示，將phyC中各物質的含量轉換為相對于WT的百分比。在孕穗期、齊穗期、灌漿期這3個時期，phyC葉片葉綠素合成代謝中間產物ALA、PBG、UrogenⅢ、Proto Ⅸ、Mg-Proto Ⅸ、Pchlide含量均顯著高于WT（齊穗期ALA除外），而只有Chla、Chlb在灌漿期時的含量顯著低于WT。這表明灌漿期phyC葉綠素的生物合成可能是在Pchlide合成Chla這一步中受到了影響，該過程中需要光的參與，因此說明PHYC基因的突變對光的吸收有一定影響，最終導致phyC葉片的葉綠素含量減少，光合作用減弱。

2.2 光合參數分析

植物生長發育所必需的物質和能量是由光合作用來提供的，通過分析光合參數，可以評估植物對光能的利用效率和光合速率等關鍵指標。由圖 2-A可知，從孕穗期、齊穗期到灌漿期，phyC的凈光合速率呈先升后降的趨勢。在孕穗期、齊穗期，phyC的凈光合速率比WT高17.9%、29.6%；而在灌漿期，WT的凈光合速率上升，比phyC高 215%；這與3個時期葉綠素含量的結果趨勢一致。由圖 2-B 可知，在孕穗期和齊穗期，phyC的蒸騰速率變化趨勢與凈光合速率一致，但在灌漿期phyC的蒸騰速率依舊高于WT。由圖2-C可知，灌漿期phyC的胞間二氧化碳濃度極顯著低于WT（Plt;0.01），光合速率的下降也可能與胞間二氧化碳濃度有關。由圖2-D可知，在3個時期，phyC的氣孔導度都高于WT，并且呈先升后降的趨勢。光合參數的結果驗證了phyC的葉綠素含量與光合速率呈正相關性。

2.3 葉綠素熒光參數比較分析

植物葉綠素熒光動力學參數的變化可以指示植物光合作用的變化。由圖3-A可知，在孕穗期，phyC的單位反應中心吸收的光能（ABS/RC）、耗散的光能（DIo/RC）、捕獲的光能（TRo/RC）均高于WT，分別高10、12、9百分點。另外PSⅠ端還原電子的效率（REo/RC）也高于WT。但單位面積進入電子傳遞鏈中的還原能（ETo/CSm）、用于電子傳遞的能量（ETo/CSo）卻低于WT。另外phyC的綜合性能指數（以吸收為基礎）（PIabs）高于WT。由圖3-B可知，在齊穗期，與WT相比，phyC以上參數的表現和孕穗期一致；其中單位葉面積熱耗散（DIo/CSm），phyC比WT有所上升。此外，在這2個時期，phyC的PSⅡ末端電子受體的效率（ΦE0）都低于WT。由圖3-C可知，到灌漿期，與WT相比，phyC的單位反應中心和單位面積吸收、耗散、捕獲的光能以及單位面積進入電子傳遞鏈中的還原能和用于電子傳遞的能量均下降。說明隨著水稻的逐漸成熟，phyC的光合效率以及植物吸收傳遞轉化光能的效率逐漸下降，并低于WT，這與灌漿期葉片的葉綠素含量結果相一致。

2.4 葉綠素合成與降解相關基因表達水平分析

為了驗證敲除PHYC是否影響葉綠素合成和降解的相關基因，使用qRT-PCR技術來分析基因的表達水平。黃化基因OsCAO1編碼葉綠素a加氧酶，是催化葉綠素a合成葉綠素b的關鍵酶。由圖4-A、圖4-B、圖4-C可知，在3個生育期，相比WT，編碼葉綠素合酶的CS基因、編碼NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶的PORA基因、CAO1基因在phyC中表達量都有所上調。此外，NYC1編碼葉綠素b還原酶，控制葉綠素的降解。由圖4-D可知，在phyC中，NYC1的表達水平反而都提高了，尤其是在齊穗期。說明突變體phyC中葉綠素的降解可能也變多了，但對最終的葉綠素含量影響不大。綜合來說，敲除PHYC可以正調控葉綠素合成相關基因的表達，進而合成更多葉綠素，提高光合速率。

3 討論

葉綠素位于光合作用的場所——葉綠體的類囊體膜上，是重要的捕光色素。部分特殊的葉綠素a作為光合作用的中心色素分子，進行電子傳遞并將光能轉化為化學能；而葉綠素b具有吸收光能和傳遞光能的作用。在一定范圍內葉綠素含量與葉片光合速率呈正相關［25］，葉綠素a含量/葉綠素b含量與光合作用速率呈負相關［26］。在前人的研究中，發現光敏色素可以參與調控葉綠素的合成［11-14］。但其中主要都是關于PHYA、 PHYB的研究， 而有關水稻中PHYC對葉綠素調控的研究較少。

本研究以敲除光敏色素PHYC的水稻突變體作為主要研究對象，探究光敏色素PHYC與葉綠素合成以及光合熒光參數之間的關系。研究結果表明，在孕穗期和齊穗期，phyC的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量都高于WT；而在灌漿期顯著下降，低于WT。結合葉綠素a含量/葉綠素b含量，說明phyC在孕穗期、齊穗期都具有更高的捕光效率，但灌漿期有所下降。水稻合成葉綠素是一個由多種酶參與的復雜過程［27-28］，在合成葉綠素前先要合成很多前體物質，其中主要前體包括：Glu→ALA→PBG→Urogen Ⅲ→Proto Ⅸ→Mg-proto Ⅸ→Pchlide→Chla→Chlb；其中任何一個物質的合成遭破壞都會影響最終的葉綠素合成。本研究測定了葉綠素前體物質的含量，發現在3個生育期phyC的前體含量都高于WT；說明在灌漿期phyC突變體的葉綠素含量下降并不是因為上述某個葉綠素前體的合成過程受阻，而是在Pchlide到Chla合成過程中受到了一定的影響。該過程需要光的參與，可以推測在類囊體膜上光系統蛋白復合物中，例如捕光色素蛋白復合體降解較多，在之后的試驗中會進行驗證。之后對WT、phyC的光合參數和葉綠素熒光動力學參數的比較分析，發現phyC的凈光合速率以及單位反應中心吸收、捕獲和耗散的光能在孕穗期和抽穗期高于WT，在灌漿期卻低于WT。該結果與葉綠素含量的規律具有一致性。猜測在灌漿期可能是高溫環境影響了蛋白水平，導致水稻光合性能下降。

本研究還通過熒光定量PCR測定了幾個有關葉綠素合成基因的表達量，發現phyC突變體中參與葉綠素合成的基因的表達水平高于WT，說明了敲除PHYC正調控葉綠素的合成。研究表明，水稻光敏色素介導的光信號主要通過調控PORA的表達而影響葉綠素的合成［13］，而光敏色素Ｂ可以正調控水稻葉綠素合成。PHY二聚化是植物中常見的現象，先前的研究發現了水稻中PHYC、PHYB異二聚的結果；水稻PHYC以PHYB/PHYC異源二聚體和PHYC單體形式存在，在沒有PHYB時只以單體形式存在［10］。因此猜測敲除PHYC會影響PHYC/PHYB異源二聚體的形成，使得PHYB同型二聚化變多，進而去正調控葉綠素合成基因的表達量。

綜合看來，敲除PHYC可通過影響水稻的葉綠素含量進而影響水稻的熒光特性以及光合特性，最終可能對水稻的產量有一定影響。目前關于水稻光敏色素對光合的影響研究非常少，其中的調控機制尚不清楚。本研究通過分析敲除PHYC對葉綠素合成以及熒光特性的影響，旨在為光敏色素調控水稻光合特性機制的研究提供一些理論基礎。

未來的研究可以進一步探索phyC突變體的光合特性及分子特性，以及開發利用這些知識來改善作物的光合能力和產量性狀。

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