百香果SUS基因家族鑒定與表達分析

摘要：百香果（Passiflora edulis Sims）雖原產熱帶地區，但高溫也會影響其開花坐果，進而影響產量。果實糖含量不僅影響果實風味品質，還可以作為滲透調節物質參與高溫、干旱、鹽害等逆境脅迫。蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）是蔗糖代謝的關鍵酶之一，在植物糖積累及非生物脅迫響應中具有重要功能。對百香果SUS基因家族成員進行鑒定和生物信息學分析，并分析其在低溫脅迫下的表達變化。運用生物信息學方法，對百香果蔗糖合成酶基因進行全基因組鑒定與基因結構、系統發育關系、蛋白質保守功能域、染色體定位分析，利用轉錄組數據分析其表達模式，利用qRT-PCR技術分析其在高溫處理下的表達。結果顯示，百香果中包含5個SUS基因，分布在4條染色體上，外顯子數量為13～15個。5個SUS基因家族成員可分為三大類，即SUSⅠ、SUSⅡ、SUSⅢ，百香果SUS基因家族成員啟動子中含有激素響應、逆境響應相關的順式作用元件。表達模式分析表明，PeSUS3基因在百香果葉片和果皮中的表達量均較高。qRT-PCR分析表明，PeSUS1、PeSUS2基因在高溫處理后表達量顯著下降，PeSUS5基因表達量顯著性上升，說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因可能在百香果高溫脅迫中發揮重要的調控作用。

關鍵詞：百香果；蔗糖合酶；高溫脅迫；表達分析

中圖分類號：S667.901文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）11-0045-06

百香果（Passiflora edulis Sims）是西番蓮科西番蓮屬藤本植物，別名雞蛋果、洋石榴等，原產于大、小安的列斯群島，目前廣泛種植于我國廣東、海南、福建、云南、臺灣等省份［1］。百香果具有很高的食用、觀賞和藥用價值，近年來在我國熱帶和亞熱帶地區得到廣泛推廣［2-3］。

可溶性糖含量是果實風味品質形成的主要因素，果實中的可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖等［4-5］。高等植物在進行光合作用的過程中會產生大量蔗糖，蔗糖合成酶（sucrose Synthase，SUS）則在植物蔗糖代謝生理過程中發揮關鍵作用，對蔗糖的轉運和積累有著重要影響［6］。蔗糖合成酶最早是在小麥胚芽中被發現的［7］，主要起分解蔗糖的作用，參與植物生長發育的多個過程，如源、庫組織之間蔗糖的分配［8］、淀粉的生物合成［9］、植物纖維素的合成［10］、非生物脅迫響應［11］等。

近年來，隨著測序技術的飛速發展，許多植物的基因組信息被破譯，為SUS基因家族成員的鑒定奠定了基礎。陳成等從海沃德獼猴桃基因組中鑒定出7個SUS成員，發現AdSUS2.2與果實中蔗糖、果糖、葡萄糖含量的相關性最高，說明其是調控獼猴桃果實蔗糖合成積累的重要基因［12］。王亞娜等鑒定了6個檸檬蔗糖代謝關鍵酶ClSUS基因家族成員，qRT-PCR分析表明，ClSUS4基因對檸檬果實可溶性糖積累可能具有重要作用［13］。呂佳紅等從梨中鑒定出17份SUS基因家族成員，qRT-PCR分析、調控網絡分析表明，PbrSUS2、PbrSUS15可能參與調控梨果實的蔗糖合成與積累［14］。

百香果基因組測序在2021 年完成［1］，這表明在全基因組水平上進行百香果相關基因家族分析成為可能。何銳杰等從百香果基因組中鑒定出11個CHS基因家族成員，發現PeCHS基因在果皮顏色的形成及逆境脅迫條件下發揮重要作用［15］。Liang等研究鑒定了138個百香果bHLH基因家族成員，篩選出可能調控不同花器官和果實發育的PebHLHs基因，其中許多基因在不同脅迫處理下存在表達差異［16］。百香果SUS基因家族成員的鑒定與分析迄今未見報道。本研究基于基因組信息對百香果SUS基因家族成員進行鑒定，分析其在高溫脅迫下的表達變化，以期為百香果SUS基因功能的進一步研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2023年4—5月在福建農林大學園藝學院園藝植物細胞與分子遺傳學實驗室完成。

1.2 百香果SUS基因家族成員的鑒定

從擬南芥基因組數據庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）獲取擬南芥SUS蛋白序列，從國家基因庫生命大數據平臺（China National GeneBank DataBase，CNGBdb）獲取百香果基因組序列［1］。選用模式植物擬南芥的SUS基因成員蛋白序列為query，在百香果的蛋白質數據庫中進行同源對比，條件設定為E值lt;1×10-5，篩選出百香果SUS基因家族候選序列，進一步利用NCBI-CCD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）和Pfam數據庫（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/#table）對其結構域進行鑒定，將僅含有蔗糖合成酶結構域（sucrose-synth，PF00862）和糖基轉移酶結構域（glycos-transf-1，PF00534） 的蛋白序列作為百香果SUS基因家族候選序列［17］。

1.3 百香果SUS基因編碼的蛋白質理化性質分析

運用TBtools軟件進行百香果蔗糖合成酶（SUS）蛋白理化性質分析。通過DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）、SignalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/） 在線軟件，分別預測蛋白跨膜結構、信號肽、亞細胞定位情況。

1.4 百香果SUS基因的染色體定位、基因結構、系統進化和保守motif分析

運用MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）網站在線分析預測百香果SUS家族成員的染色體定位；運用TBtools軟件分析百香果SUS家族成員的基因結構；運用MEME Suite在線軟件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）預測百香果SUS蛋白保守Motif圖，Motif 數量設置為8，其余參數默認不作設置。將擬南芥、水稻的SUS基因家族成員與百香果的進行多序列比對后，利用 MEGA 11軟件構建進化樹，Bootstrap重復1 000次，其余參數默認不作設置。

1.5 百香果SUS基因啟動子的順式作用元件分析

利用Tbtools 提取基因成員轉錄起始位點上游2 000 bp 的序列，利用 P1antCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 進行PeSUS基因順式作用元件預測，并進一步利用Tbtools進行數據可視化處理。

1.6 百香果SUS基因家族成員的表達模式分析

基于從NCBI獲得的公共轉錄組數據（PRJNA634206）和筆者所在課題組保存的百香果轉錄組數據，分析百香果SUS基因家族成員在不同品種果皮和葉片中的表達模式。基于FPKM（每 1 000 個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片）定量分析各基因表達水平，并利用TBtools軟件繪制表達熱圖。

1.7 百香果SUS基因在高溫處理下的表達分析

對苗齡為2個月的欽蜜9號百香果幼苗進行40 ℃高溫脅迫處理6 h，以28 ℃生長的植株為對照，處理、對照各設3株。處理完成后，取相同部位的百香果葉片樣品并立即用液氮冷凍，在-80 ℃保存備用。采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取RNA；cDNA合成按照TransGen的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行［15］。選用Pe60S基因作為內參基因［18］，采用實時熒光定量 PCR 檢測各基因的表達量水平，所用引物序列見表1。所用試劑為SYBR GreenⅠ Master Mix （TaKaRa），所用儀器為LightCycler 96 Real-Time PCR Systems（Roche）。使用2-ΔΔCT方法［19］計算相對表達量，并利用SPSS軟件中的Duncan’s新復極差法對試驗數據進行顯著性分析。利用Prism 9軟件繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 百香果SUS基因家族成員的鑒定

由表2可知，從百香果基因組中鑒定出5個SUS成員，命名為PeSUS1～PeSUS5。其中PeSUSs基因長度為3 968～6 765 bp；但其編碼區長度變化較小，為2 391～2 520 bp。G+C含量為0.40～042，A+T含量為0.58～0.60。

2.2 百香果SUS蛋白理化性質分析

由表3可知，PeSUS5基因有最少的氨基酸數（796個）、分子量（91 523.73 u），PeSUS2有最多的氨基酸數（839個）、分子量（96 524.79 u）；蛋白質等電點在5.37～6.89之間，均＜7，說明均為酸性蛋白；5個家族成員的不穩定系數均在40以下，說明這些蛋白質較穩定，其中PeSUS2基因具有最強的穩定性；脂肪系數為84.50～94.64；平均親水性系數均為負值，說明百香果SUS基因家族蛋白均為親水性蛋白；由亞細胞定位分析可見，百香果SUS基因表達產物大部分定位于細胞質中，因此可推測該家族蛋白主要參與胞質基因組轉錄調控。

2.3 百香果SUS基因家族染色體定位分析

如圖1所示，百香果5個SUS基因分布在1、4、6、9號染色體上，其中9號染色體上有2個成員，其余3條染色體上各含有1個成員。

2.4 百香果SUS基因家族成員的基因結構及編碼的蛋白質的保守基序分析

如圖2所示，百香果SUS基因家族成員含有內含子數量較多，介于12～14個之間；其中PeSUS3基因最多，含有14個，PeSUS2基因最少，含有12個。

由圖3可知，百香果SUS基因家族成員之間所包含的保守基序的種類、數量、位置均存在不同程度的差異，大致可分為3類，成員PeSUS1包含 Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19；成員PeSUS3、PeSUS4相較于成員PeSUS1多了Motif 18；成員PeSUS2、PeSUS5相較于成員PeSUS3、PeSUS4多了Motif 20。其中 Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19的保守性最高，因此Motif 1～Motif 11、Motif 13～ Motif 17、Motif 19是百香果蔗糖合酶基因編碼蛋白的重要組件。

2.5 百香果SUS基因家族的進化分析

將擬南芥SUS基因家族、水稻SUS基因家族、百香果SUS基因家族成員進行多序列比對，其進化樹如圖4所示。結果顯示，SUS基因家族共分為3個亞家族，其中PeSUS2、PeSUS4、PeSUS5屬于SUSⅠ亞家族，PeSUS1屬于SUSⅢ亞家族，PeSUS3屬于SUSⅡ亞家族。

2.6 百香果SUS基因家族成員啟動子的順式作用元件分析

如圖5所示，PeSUS基因家族共鑒定出16種不同順式作用元件，包括參與干旱誘導MYB結合位點、低溫、分生組織表達、光、茉莉酸甲酯、胚乳表達、赤霉素、創傷、缺氧特異性誘導增強子、防御和脅迫、生長素、水楊酸、脫落酸、厭氧誘導、蛋白質結合位點和玉米代謝順式作用元件，大致可分為3類，即生長發育相關、激素相關、逆境相關，表明PeSUS家族在百香果的不同生長階段以及應對不同的環境條件都具有重要的作用。其中，生長發育相關的順式作用元件占比最多，尤其是光順式作用元件，說明PeSUS家族對百香果生長發育調控具有重要作用。

2.7 百香果SUS基因家族成員的組織表達模式分析

如圖6所示，百香果SUS各基因在葉片中的表達量有差別，其中PeSUS3基因的表達量最高，PeSUS5基因的表達量位于其次，PeSUS1、PeSUS2基因的表達量較低，PeSUS4基因在葉片中幾乎不表達；推測PeSUS3對百香果葉片生長具有一定作用。5個成員在不同發育時期果實果皮中的表達趨勢與葉片中基本一致。

2.8 百香果SUS基因在高溫處理下的表達分析

如圖7所示，對欽蜜9號百香果進行6 h的高溫脅迫處理后，對其PeSUS基因進行表達分析。其中，PeSUS1、PeSUS2基因的表達量均顯著下調（Plt;0.05），PeSUS5基因的表達量極顯著上調（Plt;001）；而PeSUS3基因的表達量有所下降，PeSUS4基因的表達量有所上升，但兩者表達量變化均無顯著性差異。

3 討論

本研究發現，百香果SUS基因家族中含有5個成員，其數量與目前已發現的一些物種相似，即擬南芥有6個［17］、水稻有7個［20］、檸檬有6個［13］、辣椒有5個［21］等。5個家族成員基因結構相似，進化分析結果顯示，百香果中的SUS成員分為3個亞家族，類似的結果在擬南芥［17］、豌豆［9］、無籽蜜柚［22］[JP+1]中都有發現。基因的組織表達模式與其功能特征密切相關，利用轉錄組數據開展的基因表達模式分析表明，PeSUS3基因在百香果2個品種的葉片、果皮中表達量均最高，推測此基因在百香果生長發育過程中可能擔任較為重要的角色，但未來還需進一步探究該基因的具體生理作用和調控機制等。

前人的相關研究已經表明，SUS家族成員在植物逆境脅迫中發揮重要作用，例如BoSUS1a、BoSUS1b基因表達水平在低溫處理后的耐冷甘藍CT-923葉片中急劇升高［23］，干旱脅迫下發菜Sus2在轉錄水平的表達量逐漸增加［24］。部分研究的啟動子順式作用元件分析發現，百香果SUS基因家族成員啟動子存在大量的逆境響應元件，暗示該家族基因可能也會參與百香果的逆境脅迫響應。高溫處理后PeSUS1、PeSUS2基因的表達量顯著下降，PeSUS5基因的表達量極顯著上升，說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因在高溫脅迫中發揮重要調控作用。

本研究從百香果基因組中鑒定出5個PeSUS基因家族成員， 其編碼的氨基酸具有不同的理化性質。系統進化樹顯示5個PeSUS蛋白被分為3個亞家族，且亞家族Ⅰ中包含3個成員。PeSUS3基因在2個品種葉片和果皮中的表達量最高，很可能在百香果葉片蔗糖合成和運輸中發揮作用。PeSUS3基因的生物學功能還需進一步研究驗證，期待本研究結果可為PeSUS候選基因功能的深入研究提供理論基礎，為百香果的分子育種提供一定的理論依據和基因資源。

參考文獻：

［1］Ma D N，Dong S S，Zhang S C，et al. Chromosome-level reference genome assembly provides insights into aroma biosynthesis in passion fruit （Passiflora edulis）［J］. Molecular Ecology Resources，2021，21（3）：955-968.

［2］唐語琪，楊其軍，冼淑顏，等. 百香果產業支撐鄉村振興的現狀與對策建議［J］. 中國農業文摘（農業工程），2021，33（3）：31-32，60.

［3］Xia Z Q，Huang D M，Zhang S K，et al. Chromosome-scale genome assembly provides insights into the evolution and flavor synthesis of passion fruit （Passiflora edulis Sims）［J］. Horticulture Research，2021，8：14.

［4］Fang T，Peng Y，Rao Y，et al. Genome-wide identification and expression analysis of sugar transporter （ST） gene family in Longan （Dimocarpus longan L.）［J］. Plants，2020，9（3）：342.

［5］Vimolmangkang S，Zheng H Y，Peng Q，et al. Assessment of sugar components and genes involved in the regulation of sucrose accumulation in peach fruit［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016，64（35）：6723-6729.

［6］Koramutla M K，Ram C，Bhatt D，et al. Genome-wide identification and expression analysis of sucrose synthase genes in allotetraploid Brassica juncea［J］. Gene，2019，707：126-135.

［7］Cardini C E，Leloir L F，Chiriboga J. The biosynthesis of sucrose［J］. Journal of Biological Chemistry，1955，214（1）：149-155.

［8］Haigler C H，Ivanova-Datcheva M，Hogan P S，et al. Carbon partitioning to cellulose synthesis［J］. Plant Molecular Biology，2001，47（1/2）：29-51.

［9］Paul Barratt D H，Barber L，Kruger N J，et al. Multiple，distinct isoforms of sucrose synthase in pea［J］. Plant Physiology，2001，127（2）：655-664.

［10］Fujii S，Hayashi T，Mizuno K. Sucrose synthase is an integral component of the cellulose synthesis machinery［J］. Plant and Cell Physiology，2010，51（2）：294-301.

［11］Harada T，Satoh S，Yoshioka T，et al. Expression of sucrose synthase genes involved in enhanced elongation of pondweed （Potamogeton distinctus） turions under anoxia［J］. Annals of Botany，2005，96（4）：683-692.

［12］陳 成，王 依，楊 勇，等. 獼猴桃蔗糖合酶基因家族鑒定及果實發育過程表達分析［J］. 分子植物育種，2023，21（12）：3866-3875.

［13］王亞娜，盧 闖，楊云龍，等. 檸檬蔗糖代謝關鍵酶基因家族鑒定及表達分析［J］. 南方農業學報，2023，54（5）：1327-1340.

［14］呂佳紅，王英珍，程 瑞，等. 梨蔗糖合成相關酶SUS和SPS基因家族的鑒定與表達分析［J］. 園藝學報，2018，45（3）：421-435.

［15］何銳杰，方 庭，余偉軍，等. 西番蓮查爾酮合成酶（CHS）基因家[CM（25*2/3][KG*8]族全基因組鑒定及表達模式［J］. 應用與環境生物學報，2022，28（4）：1066-1075.

［16］Liang J X，Fang Y Y，An C，et al. Genome-wide identification and expression analysis of the bHLH gene family in passion fruit （Passiflora edulis） and its response to abiotic stress［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2023，225：389-403.

［17］Baud S，Vaultier M，Rochat C.Structure and expression profile of the sucrose synthase multigene family in Arabidopsis［J］. Journal of Experimental Botany，2004，55（396）：397-409.

［18］Munhoz C F，Santos A A，Arenhart R A，et al. Analysis of plant gene expression during passion fruit-Xanthomonas axonopodis interaction implicates lipoxygenase 2 in host defence［J］. Annals of Applied Biology，2015，167（1）：135-155.

［19］Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2ΔΔCT method［J］. Methods，2001，25（4）：402-408.

［20］Hirose T，Scofield G N，Terao T.An expression analysis profile for the entire sucrose synthase gene family in rice［J］. Plant Science，2008，174（5）：534-543.

［21］魏華偉，柴松琳，胡克玲，等. 辣椒屬蔗糖合酶基因家族的鑒定及表達［J］. 分子植物育種，2019，17（14）：4537-4544.

［22］鄧舒雅，麥貽婷，陳惠萍，等. 無籽蜜柚蔗糖合成酶（SUS）和蔗糖轉化酶（INV）基因家族生物信息學及表達分析［J］. 植物生理學報，2018，54（10）：1576-1586.

［23］張 偉，余方偉，李建斌，等. 甘藍蔗糖合成酶基因家族鑒定及響應低溫脅迫表達模式分析［J］. 江蘇農業科學，2021，49（2）：24-32.

［24］李曉旭，丁苗苗，劉 陽，等. 干旱脅迫下發菜蔗糖合成酶基因Sus2[WTBZ][STBZ]克隆與差異表達［J］. 分子植物育種，2018，16（20）：6662-6669.