β-氨基丁酸誘導馬鈴薯Y病毒抗性及信號轉導途徑研究

摘要：馬鈴薯Y病毒（PVY）是目前馬鈴薯、煙草等作物生產過程中危害最嚴重的病毒病之一，嚴重影響作物產量和品質。為探究β-氨基丁酸（BABA）對植物PVY抗性的誘導作用，以煙草品種Samsun為試驗材料，通過對葉面噴施BABA，探究BABA對煙草PVY抗性的誘導作用及信號轉導途徑。結果表明，葉面噴施BABA可有效誘導煙草對PVY的抗性，其中5 mmol/L BABA對煙草PVY抗性誘導效果最明顯。與對照相比，對感染PVY的植株噴施 5 mmol/L BABA可以使葉片明脈推遲3～4 d出現，同時抑制由PVY引起的莖部壞死程度，經qRT-PCR測定發現，在接種病毒第5、7、10、14天的植株中，BABA處理組對PVY表達量的抑制率相較于對照組分別達到98.70%、96.62%、98.40%、66.89%，病理癥狀觀察結果與分子檢測結果相符合。通過高效液相色譜外標法對樣品提取液進行分析發現，5 mmol/L BABA處理可誘導煙草內源水楊酸（SA）含量的峰值出現時間早于PVY病毒表達量峰值的出現時間，并有效調節煙草植株內活性氧動態平衡。通過qRT-PCR和H₂O₂原位表征測定得出，BABA處理在激活防御體系時，通過抑制相關抗氧化酶CAT的基因表達量，使H₂O₂在植株內適量積累，可在誘導抗性的同時降低H₂O₂對植株的毒害作用。結果表明，BABA對PVY的抗性誘導與SA作為信號分子參與誘導植株防衛基因表達過程存在緊密相關性。

關鍵詞：β-氨基丁酸；馬鈴薯Y病毒；內源水楊酸；抗性誘導；信號轉導途徑

中圖分類號：S435.32" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0151-07

收稿日期：2023-10-06

基金項目：國家馬鈴薯產業技術體系項目（編號：CARS-09-ES16）。

作者簡介：高琪昕（1990—），女，河北滄州人，碩士，講師，主要從事蔬菜學、食品保鮮貯藏技術研究。E-mail：455385116@qq.com。

通信作者：張 維，碩士，高級農藝師，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：195282415@qq.com。

馬鈴薯Y病毒（PVY）因毒源廣泛、傳播速度快等特點，成為馬鈴薯、煙草等作物生產過程中最具危害力的病毒之一，可直接導致品質和產量下降，亟需尋求高效實用的PVY防治手段及生物誘抗劑^［1-2］。在已知研究中，β-氨基丁酸（BABA）作為一種非蛋白質氨基酸，在不同作物、不同病原菌體中及不同逆境環境條件下可通過引起植株過敏反應、提高防御酶活性，產生顯著誘抗效果^［3-8］。

水楊酸（SA）最主要的作用之一是參與植物對病原的防御反應。目前已普遍認定，SA是誘發植物產生系統獲得抗性（SAR）的信號分子之一^［9-12］。在誘導因子作用下，SA被水楊酸受體蛋白（SABP）識別并與其結合，產生過氧化物及抗氧化酶活性，內源SA的積累先于SAR的產生，并且SA含量與誘導的植物抗性呈正相關。因此，本研究以煙草為試驗材料，探究BABA誘導煙草抗PVY作用的最適濃度，分析BABA的誘抗作用引起的植株內源SA含量及相關抗氧化酶基因表達量、過氧化物含量的變化，進而探討BABA誘導PVY的抗性信號途徑與SA信號轉導途徑的相關性。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2021年2月在湖南農業大學馬鈴薯工程技術研究中心實驗室完成。選取長勢一致的無毒無菌Samsun煙草幼苗，從煙株長至5～6葉期起噴施梯度濃度BABA（美國Sigma公司）溶液，以噴施超純水為對照，對頂端葉片向下第3～4張葉片進行等量噴施，每天噴施2次，連續噴施3 d，每個處理3株重復。處理3 d后接種HN-2馬鈴薯植株PVY毒源，取2 g新鮮含PVY的馬鈴薯葉片，加入5 mL磷酸緩沖液充分研磨后，對煙草植株頂端葉片向下第2張葉片均勻噴灑石英砂，再用研棒蘸取病毒液，沿葉脈方向均勻等量接種，待病毒汁液停留30 min后用超純水沖洗干凈。接種后將植株置于20 ℃黑暗條件下培養12 h，隨后放進晝夜溫度為22 ℃/20 ℃、光—暗周期為16 h—8 h的光照培養箱內培養，每天噴施2次BABA溶液及超純水，直至取樣。

試驗發現，5 mmol/L BABA可以顯著誘導煙草PVY抗性，因此后續研究基于5 mmol/L的BABA溶液濃度開展。噴施5 mmol/L BABA溶液及清水（CK）3 d后，對不同噴施處理的植株分別進行PVY接種及磷酸緩沖液假接種（mock），試驗分為4個處理：處理1（CK+mock）、處理2（5 mmol/L BABA+mock）、處理3（CK+PVY）、處理4（5 mmol/L BABA+PVY）。分別在接種第5、7、10、14天（5、7、10、14 dpi）切取4組處理植株接種葉以上3張葉，用液氮迅速冷凍后在-80 ℃超低溫冰箱保存備檢，各處理均重復3次。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 BABA誘導煙草PVY抗性的最適濃度測定及表型觀察

分別用1、3、5、7、9 mmol/L BABA溶液及超純水（對照）處理葉片并接種PVY，在不同接種天數觀察植株葉片、莖部、整株的生理生長情況、病毒癥狀表型并記錄，對采集到的樣品通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR，ABI StepOne Plus Real Time PCR，Applied Biosystems）進行PVY表達量檢測。

用于qRT-PCR的內參基因Actin引物以及目的基因PVY引物均采用primer premier 5.0軟件設計（表1），試驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，選用TAKARA公司的RNAiso plus總RNA提取試劑并采用SYBR Green Real time-PCR進行測定。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s條件下進行溶解曲線分析。所有程序設置3次生物學重復和3次技術重復，最終表達水平采用2^ΔΔC_T法進行定量。試驗用所有目的基因與內參基因引物均在進行定量PCR試驗前通過普通PCR擴增法檢測了其特異性，引物退火溫度與反應條件適宜，可進行后續反應步驟。

1.2.2 BABA誘導煙草抗PVY過程中內源SA含量測定

采用SA標準品（美國Sigma公司）制作SA標準溶液，依次進行高通量液相色譜（HPLC）分析，并以水楊酸峰面積（y）與對應濃度（x）進行線性回歸，得到回歸方程與相關系數。

采用“1.1”節中的接種方法處理2個對照組材料，處理1（CK+PVY）、處理2（5 mmol/L BABA+PVY），分別在5、7、10、14 dpi取樣。稱取1 g樣品，加入5 mL 50 mg/mL的三氯乙酸溶液，在室溫下超聲振蕩10 min，隨后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，將連續提取3次的上清液合并后倒入 50 mL 分液漏斗。然后分別用15、15、10 mL三氯甲烷萃取，合并有機相至濃縮瓶中，50 ℃下旋轉蒸干，加入體積比為1 ∶1的甲醇-三氯乙酸溶液，超聲溶解8 min后定容至1 mL，過程中盡量確保濃縮瓶內壁所有SA均溶解到溶液中。最后用一次性注射器吸取提取液，過0.45 μm濾膜，所得濾液采用高效液相色譜外標法進行分析。

使用Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），選取Agilent ZORBAX SA-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇（A）、100 mmol/L 磷酸（B），流速為0.8 mL/min，用20% A+80% B、50% A+50% B（20 min）、60% A+40% B （25 min）進行梯度洗脫，進樣量為 20 μL，柱溫為40 ℃，紫外波長為210 nm。

1.2.3 BABA誘導煙草抗PVY過程中抗氧化酶基因表達量及H₂O₂的測定

采用“1.1”節中的接種方法處理4個對照組材料，在接種后24 h時取4組處理植株相同部位葉片，采用二氨基聯苯胺（DAB）染色法進行H₂O₂原位表征檢測。

分別在5、7、10、14 dpi取樣，用qRT-PCR對樣品過氧化氫酶（CAT）基因表達量進行測定。用于qRT-PCR的內參基因Actin引物以及目的基因CAT引物均用primer premier 5.0軟件設計（表2），反應程序同“1.2.1”節。

1.3 數據分析

各項指標均重復測定3次，所得數據利用Microsoft Excel 2007軟件進行處理并作圖，GraphPad Prism軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 BABA誘導煙草PVY抗性的最適濃度

噴施BABA后，植株葉片表面會形成許多微小的壞死斑應激反應，促使植物進入防衛狀態。當BABA濃度超過5 mmol/L后，葉片開始出現大量較為嚴重的壞死斑點（圖1），由此可知，高濃度的BABA溶液反而對煙草葉片產生毒害作用。

PVY侵染煙草后最明顯的癥狀是莖部壞死且壞死程度與體內病毒含量緊密相關。本試驗中，在20 dpi時不同處理組植株的莖部壞死程度與BABA溶液濃度呈反比。清水處理的植株莖部褐色壞死現象十分明顯，當BABA濃度達到5 mmol/L時莖部只有零星壞死斑出現，BABA濃度高于7 mmol/L后莖部很少甚至幾乎沒有出現壞死斑，這說明 5 mmol/L BABA溶液即可對煙草內PVY的表達產生較強的抑制作用（圖2）。

結合有效性和安全性，本試驗得出結論，5 mmol/L可作為BABA溶液誘導煙草PVY抗性的最適濃度。

PVY侵染煙草后，植株表現出的最初癥狀是葉片明脈 隨著病毒含量的升高 感染葉片最終出現花葉、輕微扭曲變形癥狀，直至葉片枯萎死亡。根據接種天數觀察發現，噴施清水（CK+mock）和5 mmol/L BABA但未接種PVY（BABA+mock）的煙草植株頂端葉片健康生長無異樣，而噴施清水后接種PVY（CK+PVY）的植株頂端葉片在7 dpi便開始出現明脈，10 dpi明脈非常清晰，14 dpi明脈發展成星狀壞死且葉柄與莖部的結節處也開始壞死，30 dpi 葉柄和莖部均出現較為嚴重的褐色壞死。相比之下，噴施BABA后接種PVY（BABA+PVY）處理的植株頂端葉片直到10 dpi才開始出現輕微明脈，14 dpi明脈仍未發展成壞死斑點，30 dpi莖部輕微壞死，由此可知，BABA對煙草PVY抗性有明顯的誘導作用（圖3）。

用5 mmol/L BABA和清水分別處理接種PVY的煙草，經qRT-PCR測定發現，不同接種時間2個處理組植株體內PVY表達量有明顯差異（圖4）。與清水處理相比，在4個不同接種時間，BABA處理組對PVY表達量的抑制率分別達到98.70%、96.62%、98.40%、66.89%。說明5 mmol/L BABA對煙草PVY抗性誘導效果明顯，可有效抑制病毒積累，生理癥狀觀察與分子檢測結果相符合。

2.2 BABA對煙草抗PVY過程中內源SA含量的影響

對濃度為100.0、50.0、30.0、10.0、7.5、5.0 μg/mL 的SA標準溶液依次進行HPLC分析，得到標準曲線（圖5），曲線的線性關系良好，相關系數為0.999 88，適合定量。通過對水楊酸峰面積（y）與對應濃度（x）進行線性回歸并結合液相色譜儀器分析得到，回歸方程為y=302.985 72x-69.465 38。根據SA標準品和煙草樣品的HPLC分離效果（圖6、圖7）可知，本試驗采用的水楊酸標準品純度高，標準曲線可信；樣品采用的提取、分離方法效果良好。

由圖8可知，CK+PVY處理植株內源SA含量隨著病程發展時間的積累而逐漸增加，10 dpi之前并無明顯升高，5、7、10 dpi的SA含量分別為28.66、31.84、35.82 μg/g，10 dpi之后SA含量迅速增加，14 dpi時達到峰值，含量為50.90 μg/g，說明PVY可誘導煙草內源SA含量升高，結合不同接種時間PVY的表達量發現，誘導產生的SA含量與植株體內的PVY含量呈正相關。而BABA+PVY處理在5 dpi時便誘導植株產生大量SA，高于同期對照60.51%，7 dpi時高于同期對照47.61%。BABA誘導的感病煙草中SA含量的峰值出現時間在5～7 dpi 之間，先于對照組SA含量峰值出現時間，也先于處理后病毒表達量峰值出現時間。

2.3 BABA對煙草抗PVY過程中抗氧化酶基因表達量及H₂O₂原位表征的影響

由圖9可知，隨著接種后天數的延長，除CK+PVY處理植株中CAT基因表達量持續下降以外，其他3組處理煙草植株中的CAT基因表達量均呈先上升后下降趨勢。BABA+PVY處理植株內CAT基因表達量在5～14 dpi均低于其他處理組，說明BABA處理后，煙草植株CAT活性受到抑制，且變化趨勢與圖8中BABA處理組的SA含量變化趨勢也基本一致，推測原因是CAT作為一種SA結合蛋白，通過與SA結合抑制自身活性，從而導致H₂O₂適量積累，引起植株過敏反應，提高抗性。

煙草植株感染PVY后，活性氧在短時間內猝發是不良生理反應之一。H₂O₂原位表征是指植物組織經DAB染色后，產生H₂O₂的部位會出現紅褐色斑點。在接種24 h后4種處理的H₂O₂原位表征結果如圖10所示，處理1（CK+mock）葉片中幾乎沒有產生H₂O₂，處理2（BABA+mock）葉片上有輕微紅褐色斑點出現，處理3（CK+PVY）葉片中的H₂O₂含量明顯升高，紅褐色斑塊幾乎布滿整個葉片，說明病毒侵染會快速誘導植物產生過氧化物，從而誘導植物啟動逆境響應信號系統，但過量的過氧化物會直接造成植物DNA損傷和細胞死亡^［13-14］。處理4（BABA+PVY）葉片上的斑點多于處理2卻少于處理3，說明采用BABA噴施健康煙草植株可在短時間內誘導其產生H₂O₂，從而激活一系列轉錄因子和防衛基因的表達，提高植物抗病性；但與病毒侵染相比，BABA在誘導植物抗性的同時也可以有效抑制H₂O₂在植株內過量積累，降低H₂O₂對植株的毒害作用，在激活防御體系的同時緩解活性氧對植物的氧化損傷。

3 討論與結論

現已發現，大量植物能夠通過一些生物試劑處理，誘導產生對各類病毒病害的抗性。產生誘導抗性的植株被致病因素感染后，通過激發侵染局部小面積過敏反應（HR），控制整株感病情況。HR會促進信號分子產生，信號分子沿著韌皮部不斷傳輸，使整株產生系統獲得抗性（SAR），SAR具有持續性、系統性和廣譜性，是植物體的一種主動防御機制^［15-16］。

目前已普遍認定，SA可作為信號分子誘導植株產生SAR。在誘抗過程中，內源SA的大量積累出現在植株產生抗性之前，且SA含量與誘抗效果呈緊密的正相關性，其原理是SA與具有CAT活性的水楊酸受體蛋白（SABP）結合后，向SABP提供電子，從而抑制CAT活性，導致細胞內開始積累H₂O₂；同時，失去電子的SA以自由基形式游離在細胞中，促使部分大分子的脂質過氧化，從而激活抗性基因表達^［16-18］。

CAT因與H₂O₂親和力極強，可以有效清除細胞內線粒體電子傳遞、光呼吸、脂肪酸氧化等過程中產生的H₂O₂，從而調控細胞內部氧化還原動態平衡。一般情況下，當植物受到脅迫后，H₂O₂迸發，CAT活性會有所升高，以維持活性氧動態平衡，提高植物抗性。但有些植株在脅迫條件下會引起體內SA含量上升，而SA對CAT活性有抑制作用，主要通過產生大量活性氧誘導植株產生SAR，CAT通過分解H₂O₂產生的氧分子也會促進苯甲酸生成SA，進一步誘導SAR^［19］。本試驗中，隨著接種時間的推移，除了接種PVY（CK+PVY處理）的植株中CAT基因表達量持續下降以外，其他3組處理煙草植株中的CAT基因表達量均呈先上升后下降趨勢。噴施BABA后接種PVY（BABA+PVY）的植株CAT基因表達量低于其他處理組，且表達量與相同處理組的SA含量變化趨勢較為一致，說明BABA處理后感病煙草中CAT通過與SA結合活性受到抑制，使得H₂O₂可以在植株內適量積累，進而提高植株抗性。同時，由于BABA處理感病植株后，內源SA峰值提早出現，向H₂O₂提供電子后轉變為水楊酸自由基，誘導大分子脂質過氧化，所以在H₂O₂原位表征時，BABA+PVY處理組表現出H₂O₂并未過量積累現象。

后續試驗將進一步驗證BABA在誘導煙草抗PVY過程中對植株內抗氧化酶以及病程相關蛋白基因表達量的影響，進一步探究BABA對煙草PVY抗性的誘導機制。

本試驗中，5 mmol/L BABA對煙草PVY抗性的誘導效果明顯，可以使葉片明脈推遲3～4 d出現，同時降低由PVY引起的莖部壞死程度，對病毒積累也有抑制作用，病理癥狀觀察與分子檢測結果相符合。

BABA可誘導煙草內SA含量峰值在提前在 5～7 dpi之間出現，內源SA的積累能夠抑制感染植株內CAT活性，從而影響H₂O₂含量變化，導致抗性基因被快速激活表達，SA峰值提前出現誘導的抗性基因表達先于試驗中其他防御酶基因表達量峰值出現的時間，說明在BABA誘導煙草PVY抗性過程中，SA作為信號分子參與誘導植株防御酶基因的表達，誘導植株抗性產生。

參考文獻：

［1］張諾妮，曹 洋，梅運鵬，等. 煙草馬鈴薯Y病毒病發生規律及生物防治研究進展［J］. 北方農業學報，2022，50（2）：110-116.

［2］董環宇，楊超群，郭笑維，等. 不同抗性煙草品種（系）苗期接種PVY后生理生化指標變化［J］. 延邊大學農學學報，2022，44（3）：29-37.

［3］馬曉寒，龔治翔，王 林，等. β-氨基丁酸誘導煙草抵御脅迫的研究進展［J］. 中國農業科技導報，2018，20（5）：47-53.

［4］Wang J，Cao S F，Wang L，et al. Effect of β-aminobutyric acid on disease resistance against Rhizopus rot in harvested peaches［J］. Frontiers in Microbiology，2018，9：1505.

［5］雷長毅，汪開拓，黎春紅，等. β-氨基丁酸誘導采后葡萄果實敏化抗性及促進可溶性糖積累［J］. 食品與發酵工業，2023，49（12）：23-32.

［6］Jafarbeigi F，Samih M A，Alaei H，et al. Induced tomato resistance against Bemisia tabaci triggered by salicylic acid，β-aminobutyric acid，and Trichoderma［J］. Neotropical Entomology，2020，49（3）：456-467.

［7］金義蘭. β-氨基丁酸誘導藍莓對葉斑病的誘導抗病性及其基因表達研究［D］. 貴陽：貴州大學，2019.

［8］廖云霞，費良航，夏明星，等. 不同濃度β-氨基丁酸處理對葡萄果實抗病性的誘導模式［J］. 食品科學，2018，39（17）：221-228.

［9］王維領，趙 燦，李國輝，等. 水楊酸在植物抵御低溫脅迫中的作用［J］. 植物生理學報，2020，56（12）：2585-2594.

［10］Ali A，Shah L，Rahman S，et al. Plant defense mechanism and current understanding of salicylic acid and NPRs in activating SAR［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology，2018，104：15-22.

［11］Belkadhi A，de Haro A，Soengas P，et al. Salicylic acid increases tolerance to oxidative stress induced by hydrogen peroxide accumulation in leaves of cadmium-exposed flax （Linum usitatissimum L.）［J］. Journal of Plant Interactions，2014，9（1）：647-654.

［12］Lovelock D A，Sˇola I，Marschollek S，et al. Analysis of salicylic acid-dependent pathways in Arabidopsis thaliana following infection with Plasmodiophora brassicae and the influence of salicylic acid on disease［J］. Molecular Plant Pathology，2016，17（8）：1237-1251.

［13］Apel K，Hirt H. Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction［J］. Annual Review of Plant Biology，2004，55：373-399.

［14］任錫躍，劉 濤，朱發亮，等. β-氨基丁酸對煙草黑脛病的抗性誘導［J］. 煙草科技，2023，56（1）：47-51，65.

［15］黃子凌，李大勇，宋鳳鳴. 植物系統獲得抗性中的系統信號及其作用機制［J］. 植物生理學報，2020，56（7）：1346-1360.

［16］高琪昕，胡新喜，王歡妍，等. 水楊酸誘導植物抗病性機制的研究進展［J］. 中國馬鈴薯，2014，28（4）：238-242.

［17］Peng D L，Liu A R，Wang W J，et al. Mechanism of growth amelioration of triclosan-stressed tobacco （Nicotiana tabacum） by endogenous salicylic acid［J］. Environmental Pollution，2021，282：117032.

［18］Pokotylo I，Kravets V，Ruelland E. Salicylic acid binding proteins （SABPs）：the hidden forefront of salicylic acid signalling［J］. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（18）：4377.

［19］Yüzba ogˇlu E，Dalyan E.Salicylic acid alleviates thiram toxicity by modulating antioxidant enzyme capacity and pesticide detoxification systems in the tomato （Solanum lycopersicum Mill.）［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2019，135：322-330.