基于混池高通量測序的花生含油量相關基因初定位

摘要：為開發花生高油相關分子標記，促進花生高油育種，并提高我國食用油自給率，以普通油酸含量高油花生品種HFLS與3個高油酸花生品種（系）花育665、花育668、FB4為親本搭配4個雜交組合，選擇含油量遺傳規律相對簡單且主基因遺傳率最高的HFLS×花育665組合，利用F₂群體構建各包括30個個體的極端高油和極端低油混池，連同親本HFLS和花育665進行高通量測序。將花生含油量基因初步定位在A02和A05染色體上，候選區間總長度分別為5.3、5.1 Mb。在候選區間內設計119對SNP和InDel引物，篩選出雙親間具有多態性的InDel標記和SNP標記共14對；利用F₂群體驗證這14對標記，經單標記分析發現，A02染色體上的4對標記（Chr02-7、Chr02-25、Chr02-65和Chr02-34）和A05染色體上的1對標記（Chr05-80）與花生含油量顯著相關，表型變異解釋率分別為46.4%、33.2%、34.8%、31.0%和28.3%。其中，標記Chr02-65、Chr02-7、Chr02-25和Chr02-34所對應的物理位置為A02染色體87 578 082～88 550 841 bp之間，區間大小約為0.97 Mb，區間內基因為37個。本研究定位區間與前人報道的無重疊，為花生高油分子育種提供了新的標記。

關鍵詞：花生；主基因＋多基因；含油量；BSA；基因定位

中圖分類號：S565.201；S565.203" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0051-06

收稿日期：2024-05-17

基金項目：國家花生產業技術體系建設專項（編號：CARS-13）；山東省農業重大技術協同推廣計劃（編號：SDNYXTTG-2024-01）；山東省農業科學院農業科技創新工程人才類任務（引進國內高層次人才）（編號：CXGC2024F20）；山東省農業科學院農業科技創新工程（編號：CXGC2024D19）；山東省重點研發計劃（編號：2022TZXD0031）；新疆維吾爾自治區重大科技專項（編號：2022A02008-3）；廣東省重點領域研發計劃（編號：2020B020219003）。

作者簡介：樊美玉（1998—），女，吉林長春人，碩士研究生，主要從事花生品質遺傳育種研究。E-mail：1026213557@qq.com。

通信作者：姜春姣，碩士，研究實習員，主要從事花生品質改良研究。E-mail：qaujcj@163.com。

我國食用油短缺，食用油自給率不足40%。花生是油、食、蔬兼用及比較優勢的經濟作物。在主要油料作物中，花生單位面積產油量最高，為油菜的2倍、大豆的4倍。在闡明花生高油性狀遺傳規律基礎上定位花生高油基因，將為培育高油花生品種提供技術支撐，對于保障我國食用油脂供應安全、降低對外依存度具有重要意義。

關于花生含油量遺傳規律和相關數量性狀基因座（QTL）定位已有研究報道。不同研究者對花生含油量遺傳規律研究的結論有所不同。于海洋等以農大D666為中心親本配置4個雜交組合及正反交構建F₂群體，利用主基因加多基因遺傳模型分析花生含油量遺傳效應，結果表明不同組合受3種遺傳模式控制，存在多個微效基因累加效應^［1］。牟大林等構建5個家系世代群體研究花生含油量的遺傳規律，發現含油量的遺傳模型為加性-顯性多基因，主要受多基因遺傳控制^［2］。陶順玉等利用親本徐花13和中花6號2個含油量差異顯著的品種通過測序開發插入缺失（InDel）標記并構建遺傳連鎖圖譜，將和含油量相關的QTL定位于A08染色體 1.2 Mb 區段內，表型變異解釋率為11.21%^［3］。曲藝偉利用濰花8號×12L49的雜交組合構成140個F₂分離群體，通過遺傳圖譜定位3個QTL，表型變異解釋率在5.50%～10.48%之間^［4］。張新友等以鄭8903×豫花4號的215個重組自交系群體構建遺傳圖譜定位到2個QTL，表型變異解釋率分別為5.25%和8.24%^［5］。

相較于傳統QTL定位方法，集群分離分析（bulked segregant analysis，BSA）法定位更加快速、準確。BSA法是可以快速確定候選區間、識別影響目的性狀的基因或遺傳位點的定位方法，利用具有極端表型的少量個體構建混池，減少大量人力、試劑等耗費成本，增加標記篩選效率，非常實用，應用廣泛，但在花生含油量基因定位上鮮有報道。

本研究以高油花生和普通含油量花生為親本雜交，構建F₂分離群體，通過BSA法對控制花生含油量的基因進行初定位研究，開發相關標記，以促進花生高油育種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以高油普通油酸花生品種HFLS為中心親本，與高油酸品種（系）花育665（HY665）、花育668（HY668）、FB4搭配4個雜交組合。父母本于2021年5月種植于山東省花生研究所萊西試驗站雜交圃（120.51°E，36.81°N），9月收獲F₁代種子。通過花生轉座子分子標記（ahTE）鑒定的真雜種，于2022年5月種植于萊西試驗站田間，2022年9月收獲F₂代種子。各組合F₂代種子粒數如下：C2105（FB4×HFLS）475粒，C2106（HFLS×FB4）662粒，C2107（HFLS×HY668）619粒，C2108（HFLS×HY665）584粒。

1.2 花生含油量測定與分析

利用 MPA型傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克光學有限公司） 采集花生籽仁光譜。單粒花生重復掃描3次，每次掃描前將樣品翻轉。采用近紅外光譜儀自帶的OPUS 7.5軟件配合團隊自建近紅外模型由光譜儀導出樣品含油量數據，取3次重復的平均值。

對這4個組合的F₂代個體進行近紅外分析測定，采用數量性狀主基因+多基因混合遺傳分析R軟件包SEA v2.0^［6］研究花生含油量遺傳規律，選擇遺傳規律相對簡單且主基因遺傳率高的雜交組合用于BSA。

1.3 基因組DNA提取、極端混池的構建和測序分析

從選中的組合F₂群體中挑選30個極端高油和30個極端低油個體，連同2個親本HFLS和HY665，取其子葉用十二烷基硫酸鈉（SDS）法進行DNA提取，將30個極端高油和30個極端低油的子葉DNA分別等量混合，構建高油和低油混池。對父母本及2個極端池共4個DNA樣品進行測序分析。DNA檢測合格后，通過Covaris儀器隨機打斷成長度為 350 bp 的片段，完成文庫制備，文庫質檢合格后，根據文庫的有效濃度及數據產出需求在 Illumina 平臺進行測序。BSA全流程包括質控（對下機得到的Raw data進行質控得到Clean data）、參考基因組比對（Clean data與選定的參考基因組進行比對）、變異檢測［根據比對結果進行單核苷酸多態性（SNP）和InDel位點檢測］、標記篩選（根據變異位點質量、測序深度、親本基因型差異情況等條件對標記進行過濾）、性狀定位（針對經上述處理后獲得的位點，選擇合適的統計方法進行混池間等位頻率的差異分析，并定義顯著區間及區間內的候選基因）。過濾不合格read，對得到的clean read，使用Sentieon軟件進行參考基因組比對分析，進行SNP和InDel位點檢測和基因注釋，確定變異位點在基因組上的區域及突變類型。

1.4 花生含油量相關基因定位

篩選親本間純合且有差異的位點，基于篩選出來的多態性標記，計算2個子代在這些標記位點的SNP/InDel-index，并過濾掉子代存在缺失的位點，選取子代indexgt;0.3的位點，按照滑窗的方法對計算獲得的SNP/InDel-index、ΔSNP/InDel-index及相關計算結果進行擬合，取窗口內的平均值作為擬合后的值，其中窗口大小和使用步長根據基因組大小確定，滑窗時使用的窗口大小為1 Mb，使用的步長大小為100 kb。選擇99%或者95%置信水平下，大于閾值的窗口作為候選區間。利用BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對候選基因進行篩選和功能預測。

1.5 分子標記的開發

篩選SNP/InDel差異位點，進一步在BSA初定位區間內提取該變異位點前后150～500 bp的序列，在候選區間內變異位點設計均勻分布的引物。引物長度20～25 bp，T_m為55～65 ℃，GC含量 40%～60%，交由青島蔚來生物科技有限公司和通用生物（安徽）股份有限公司合成。用合成的引物對DNA進行PCR擴增，PCR擴增體系（20 μL）為TaqMix 10 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各 1 μL、ddH₂O 7 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行帶型統計或送青島蔚來生物科技有限公司測序。瓊脂糖凝膠電泳采用3%濃度，電壓90 V，電泳時間30～120 min。

2 結果與分析

2.1 用于花生含油量相關基因初定位的雜交組合選擇

對選中的4個組合的含油量遺傳分析，結果（表1）表明，C2105和C2106最適遺傳模型均為 2MG-EA（2對主基因等加性效應），C2107和C2108最適遺傳模型均為2MG-A（2對主基因加性效應），主基因遺傳率分別為77.52%、41.41%、80.18%和97.42%。在4個組合中，組合C2108含油量遺傳規律較簡單，主基因遺傳率最高，因此用于下一步的基因定位。

2.2 C2108組合雙親及含油量高低池基因組重測序和變異位點檢測

對C2108組合2個F₂群體極端池（極端高油池、極端低油池）和雙親（HFLS、HY665）進行全基因組測序（表2），得到read總條數分別為238 468 318、249 325 338、670 132 052、612 796 102 bp，與比對read數基本一致，與參考基因組的比對率（mapping rate）均在99%以上，4個樣品的GC含量在 36.76%～38.32%之間，覆蓋率1X和4X均在96%以上。

檢測到親本HFLS和HY665之間多態性位點SNP和InDel分別共獲得911 743、307 264個，SNP位點的數量顯著多于InDel位點的數量，其中SNP和InDel分別共258 456、827 702個多態性位點分布在基因間區，分別共11 488、16 297個位點位于基因上游。非同義變異位點SNP為10 282個，同義突變位點數量為 5 907 個。

2.3 對C2108組合含油量區域關聯和候選基因篩選

ΔSNP/InDel-index曼哈頓圖如圖1所示，選擇99%或者95%置信水平下，大于閾值的窗口作為候選區間，最終得到2號染色體區域83 350 000～88 650 000 bp 和5號染色體區域23 800 000～28 900 000 bp，區域總長度分別為5.3、5.1 Mb，分別包含148、251個基因。

2.4 候選區間內分子標記分析

根據BSA結果，在2號和5號染色體定位區間共設計119對PCR引物，利用親本HFLS和HY665的DNA篩選出雙親間有多態性的InDel標記和SNP標記共14對（表3）。

其中，從初期設計的20對InDel引物中篩選出3對（引物Chr02-55、Chr02-65和Chr05-80），其PCR產物條帶清晰且目標片段大小差異顯著。進一步利用這3對引物對F₂代高油和低油花生各10個樣品進行基因型分析。圖2為其中2對InDel引物擴增產物的膠圖。

根據染色體定位區間內特異位點所設計的SNP引物，用雙親DNA擴增，其PCR產物在瓊脂糖凝膠上呈清晰可辨的單一條帶，則直接進行Sanger測序，利用DNAstar比對序列，最終發現2號染色體上雙親PCR產物目標位點存在差異的SNP引物有11對，有堿基差異的進一步用子代驗證（圖3、圖4）。

根據F₂代個體基因型與表型數據，分別對14個位點進行獨立樣本t檢驗，最終得到5個位點不同基因型間含油量存在顯著或極顯著差異（表4）。

分析結果（表4）表明，有5個標記（Chr02-7、Chr02-25、Chr02-65、Chr02-34和Chr05-80）經t檢驗可知P值均小于0.05。其中1個標記（Chr02-7）的P值小于0.01。相關系數的平方值即為表型解釋變異率，經相關性分析可知，標記Chr02-7、Chr02-25、Chr02-65、Chr02-34和Chr05-80的表型解釋變異率分別為46.4%、33.2%、34.8%、31.0%和28.3%。

其中標記Chr02-65、Chr02-7、Chr02-25、Chr02-34對應的物理位置為2號染色體 87 578 082～88 550 841 bp之間，該區間內基因共37個。對這4個標記物理位置所對應的區間內基因通過BLAST軟件多個數據庫注釋結果推測蛋白質編碼基因，對該區域內的基因在GO數據庫（http：//www.geneontology.org/）中查找基因注釋。其中3個基因在基因注釋文庫中功能未知，GO富集到的基因分細胞定位、分子功能、生物學過程3類，發現參與蛋白質的合成代謝類基因最多，其余富集到的基因與氧化還原過程、信號轉導和木質素分解代謝過程等相關。經BLAST軟件分析基因注釋結果顯示，基因W9RD48可能參與脂質代謝過程，其他基因可能存在幾種功能或者參與多個轉導合成過程，更多的功能還需進一步探索。

3 討論與結論

關于花生含油量相關QTL鑒定已有多個研究報道。張勝忠等利用花育36號和高油品系6-13為親本，構建了181個重組自交系，通過SNP及SSR標記的連鎖圖上定位到5個QTL，表型變異解釋率（PVE）為16.53%～17.39%^［7］；Jadhav等利用雜交組合TMV2×TMV2-NLM構建出含432個RIL家系，采用700個標記構建遺傳圖譜定位到11個QTL，其中含2個主效QTL^［8］；Pandey等利用2個RIL群體研究花生含油量QTL定位分別檢測到10、8個QTL，PVE分別為3.03%～25.52%和3.93%～14.07%^［9］。李玉穎等利用BSA法定位到花生籽仁含油量相關區間位于A01的 15.17～18.38 Mb區間內^［10］，Gomez等利用BSA-seq法定位到花生含油量1個QTL，PVE達到11.03%^［11］。Sun等利用豫花15×W1202構建出含329個家系的RIL群體對花生品質性狀進行全基因組測序，檢測到和含油量相關的主效QTL位于Arahy.05的6.34～7.83 Mb^［12］，同樣的，Wilson等研究定位到Arahy.05的21.79 Mb位置上^［13］，但均與本研究所定位到A05染色體候選區間并無重疊，說明本研究候選區域內存在新的QTL位點，可進行進一步研究。

本研究利用HFLS×HY665為雜交組合構建F₂分離群體，針對該組合進行BSA定位，通過分子標記縮小區間，為進一步研究花生含油量相關基因和實施標記輔助選擇奠定了基礎。

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