禽流感病毒(H9亞型)流行性毒株的分離、篩選與鑒定

摘要：為了明確2023年我國(guó)禽流感病毒H9N2亞型的流行情況，從北京、河北、河南、山東、山西、福建、四川、廣西、遼寧等地養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的50份病料進(jìn)行病毒分離鑒定，共分離到19株具有血凝性的培養(yǎng)物，對(duì)19個(gè)具有血凝性的培養(yǎng)物開(kāi)展了血清學(xué)試驗(yàn)和RT-PCR試驗(yàn)初步鑒定，其中8株鑒定為H9N2亞型禽流感病毒，接下來(lái)對(duì)8株H9N2亞型禽流感病毒進(jìn)行了HA基因測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析，同時(shí)使用8株H9N2分離株以及目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗的疫苗株制備滅活疫苗免疫SPF雞制備高免血清，開(kāi)展交叉血凝抑制試驗(yàn)，篩選出血清保護(hù)譜廣的分離株BJ23株，然后使用BJ23株在SPF雞中開(kāi)展免疫攻毒保護(hù)研究。結(jié)果表明，分離株與我國(guó)目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗株之間存在著一定的遺傳距離，HA基因的核苷酸同源性為87.5％～93.1％，8株H9N2分離株同屬于Y280種系；BJ23株對(duì)近年來(lái)分離的H9N2禽流感毒株交叉血凝保護(hù)譜廣；使用BJ23株制備的滅活疫苗免疫SPF雞后21日，使用8株分離株以及目前普遍使用的疫苗株WJ57株進(jìn)行免疫后攻毒試驗(yàn)，BJ23株制備的疫苗不僅可以抵御同源毒株的攻擊，而且對(duì)異源毒株的攻擊也可提供理想的保護(hù)。結(jié)果表明，BJ23株適合作為疫苗候選株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒；疫苗株；篩選

禽流感（Avian influenza，AIV）是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱(chēng)，是由禽流感病毒引起的一種禽類(lèi)傳染性疾病綜合征[1]。根據(jù)致病力強(qiáng)弱，在臨床上可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感。低致病性禽流感病毒感染后可致禽表現(xiàn)出輕度的呼吸道癥狀、消化道癥狀，死亡率較低[2]。H9N2亞型禽流感病毒是由8個(gè)基因節(jié)段組成的單股負(fù)鏈RNA病毒，毒力通常表現(xiàn)為低致病性，其存在廣泛并持續(xù)感染，降低禽的生產(chǎn)能力[3-4]。1992年，H9N2禽流感病毒（AIV）在廣東地區(qū)首次暴發(fā)，隨后向其他地區(qū)蔓延[5]，1998年，迅速擴(kuò)散到中國(guó)大部分省份[6]，隨后在我國(guó)大部分地區(qū)家禽群體中廣泛流行，已成為雞群中流行的禽流感病毒的主要亞型[7-8]。

H9亞型AI系列滅活疫苗，幾乎是我國(guó)獸醫(yī)生物制品中種毒株最多的疫苗。2003年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所所研發(fā)的禽流感滅活疫苗（H9N2亞型，SDS696株）獲得二類(lèi)新獸藥證書(shū)，成為我國(guó)第一個(gè)關(guān)于H9亞型AI的新獸藥。目前，我國(guó)已經(jīng)通過(guò)審批的H9亞型AI滅活疫苗已達(dá)百余種。H9亞型系列滅活疫苗涉及的H9毒株有Re-2株、SDS696株、SS株、L株、HP株、SY株、LG1株、YBF003株、F株、S2株、NJ02株、NJ01株、HZ株、JY株、HN106株、WJ57株等20余種。疫苗的大規(guī)模使用對(duì)禽流感的防控確實(shí)發(fā)揮了重要作用。近些年間 H9N2亞型禽流感的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)前流行的H9N2病毒在遺傳進(jìn)化和抗原性分析方面均發(fā)生了比較顯著的變化，其中HA基因遺傳進(jìn)化分支已演變?yōu)橐訷280亞系占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[9-10]。這提示我們，應(yīng)該盡快篩選新的H9N2疫苗株用于研制新型疫苗，以應(yīng)對(duì)已出現(xiàn)變異的H9N2亞型禽流感的防控。

1 材料

1.1 樣品

樣品為采自北京、河北、河南、山東、山西、福建、四川、廣西、遼寧等地養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的50份發(fā)病雞肺臟、喉頭、氣管等組織。

1.2 種蛋及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF種蛋及SPF雞購(gòu)自北京勃林格殷格翰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 陽(yáng)性血清

H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；H5、H7亞型禽流感病毒HI陽(yáng)性血清由乾元浩生物股份有限公司提供；雞新城疫陽(yáng)性血清和EDS76HI陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 試劑

總RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、DL 2000 Marker等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD18-T載體試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

2 方法

2.1 病毒分離

1）樣品處理。取采集發(fā)病雞的肺臟、喉頭、氣管、肝臟、脾臟、輸卵管等組織，與適量的生理鹽水加入EP管中，使用振蕩不銹鋼株法充分研磨病變組織，經(jīng)5 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液過(guò)濾除菌后備用。

2）雞胚接種。將上清液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，0.2 mL/胚，37 ℃孵化箱中培養(yǎng)，每日檢胚1次，24 h內(nèi)死亡的雞胚棄去，24 h后死亡的雞胚隨時(shí)收獲，至96 h，取出全部雞胚，分別收獲雞胚液，留樣進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。

2.2 病毒鑒定

1）血清學(xué)鑒定。取血凝陽(yáng)性的樣品配制成4HAU抗原，通過(guò)雞新城疫HI陽(yáng)性血清，EDS76HI陽(yáng)性血清，禽流感H9亞型特異性抗血清、H5、H7亞型特異性抗血清、SPF雞血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)開(kāi)展血清學(xué)鑒定。

2）RT-PCR試驗(yàn)分型鑒定。取血凝陽(yáng)性樣品，用EasyPure Viral DNA/RNA K提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用H9N2亞型分型鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定大小正確后，送測(cè)序公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。使用DNA STAR軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接。從Gen Bank中獲得具有代表性的H9N2亞型禽流感病毒的HA基因序列，及國(guó)內(nèi)部分H9亞型禽流感滅活疫苗產(chǎn)品所用疫苗株的HA基因序列，使用軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2.3 候選毒株的免疫效力研究

1）交叉HI試驗(yàn)。8株無(wú)外源病毒污染的病毒以及目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗所用毒株以常規(guī)方法制備油乳劑滅活苗，分別以每只0.3 mL的劑量免疫21日齡SPF雞，每種疫苗免疫5只。另設(shè)5只SPF雞不免疫作為對(duì)照，同條件飼養(yǎng)。免疫后21日，各免疫組以及同條件對(duì)照雞5只，分別采血，分離血清，使用9種病毒液的滅活抗原作為血凝抑制試驗(yàn)抗原，開(kāi)展交叉血凝抑制試驗(yàn)。

2）攻毒和病毒分離。篩選出血清保護(hù)譜廣的分離株，使用制備的滅活疫苗免疫21日齡SPF雞， 每只0.3 mL，免后21日，使用9株病毒液分別進(jìn)行攻毒，10只/組。攻毒方法為：將病毒液用PBS（0.l mol/L，pH值7.0～7.4）稀釋10倍，通過(guò)靜脈注射攻毒，0.2 mL/只，每只雞攻毒劑量不低于106.0EID50。攻毒后第5日，采集喉頭與泄殖腔棉拭子，將采自同一只雞的兩種棉拭液混合后作為一個(gè)樣品，接種于10日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。對(duì)病毒分離為陰性的樣品應(yīng)盲傳1代再進(jìn)行判定。

3 結(jié)果

3.1 血清學(xué)鑒定

通過(guò)雞新城疫HI陽(yáng)性血清，EDS76HI陽(yáng)性血清，禽流感H9亞型特異性抗血清、H5、H7亞型特異性抗血清、SPF雞血清對(duì)19個(gè)血凝陽(yáng)性雞胚液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)開(kāi)展血清學(xué)鑒定。19個(gè)樣品中其中8個(gè)樣品僅與H9亞型特異性抗血清呈陽(yáng)，其余均為陰性反應(yīng)，表明所分離的8個(gè)毒株可能為H9亞型禽流感病毒。

3.2 病毒HA基因鑒定

1）病毒的RT-PCR試驗(yàn)鑒定結(jié)果。對(duì)經(jīng)過(guò)血清學(xué)鑒定可能為H9亞型禽流感的8個(gè)毒株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，使用的兩對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增出了約1 101 bp和1 038 bp大小的條帶，與預(yù)期相符。

2）病毒HA基因的遺傳進(jìn)化分析。使用軟件對(duì)分離株、疫苗株及參考株的HA基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)群系劃分，選擇分析的8株病毒的HA基因均屬于歐亞群系的Y280群系（或BJ94群系），我國(guó)目前廣泛使用的部分疫苗株（如F98、SS、WJ57、和SD696）等也均屬于Y280群系（或BJ94群系）。

3.3 候選毒株的免疫效力研究

1）取8株經(jīng)鑒定為H9亞型禽流感毒株，用β-丙內(nèi)酯滅活后制備油乳劑滅活疫苗，多點(diǎn)注射接種6周齡SPF雞，免疫1 mL/羽，接下來(lái)每次間隔2周分別進(jìn)行2免、3免，0.5 mL/羽，于三免后21天采血，分離血清，使用8種病毒液的滅活抗原作為血凝抑制試驗(yàn)抗原，開(kāi)展交叉血凝抑制試驗(yàn)，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同毒株制備的陽(yáng)性血清使用不同的檢測(cè)抗原進(jìn)行檢測(cè)，離散度最小的是BJ23株的陽(yáng)性血清，這說(shuō)明BJ23株抗原制備的陽(yáng)性血清能較好地與近年分離的H9N2禽流感毒株結(jié)合，作為候選毒株的幾率較大。

2）攻毒后病毒分離結(jié)果。攻毒后第5日，采集棉拭子并接種雞胚進(jìn)行病毒分離，結(jié)果詳見(jiàn)表4。病毒分離結(jié)果顯示， BJ23株對(duì)同源毒株和異源毒株的攻擊均可產(chǎn)生理想的保護(hù)（8/10～10/10保護(hù)）同時(shí)對(duì)目前普遍使用的H9亞型禽流感滅活疫苗（WJ57）也有很好的保護(hù)作用。

4 討論

禽流感的大范圍流行給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，疫苗免疫仍然是防止禽流感暴發(fā)的主要措施，但禽流感病毒在復(fù)制過(guò)程中很容易發(fā)生基因突變及基因重組，導(dǎo)致基因型眾多，給疫苗的研究帶來(lái)了極大的困難。近年來(lái)，對(duì)我國(guó)H9亞型禽流感病毒的分子進(jìn)化及抗原性的相關(guān)研究有不少報(bào)道。H9N2亞型禽流感病毒在我國(guó)經(jīng)過(guò)不斷的抗原漂移。研究結(jié)論部分指出。疫苗的基因同源性和抗原性差異引起的保護(hù)效力不足可能是導(dǎo)致H9亞型禽流感病毒在我國(guó)持續(xù)存在的主要原因之一。部分毒株制備的滅活疫苗免疫雞后，對(duì)同源或異源毒株的攻擊均難以提供保護(hù)，而另有部分毒株不僅可抵御同源毒株的攻擊，而且可以有效抵御異源毒株的攻擊。這說(shuō)明不同毒株之間的免疫原性存在著較大差異，必須通過(guò)多毒株之間的交叉保護(hù)試驗(yàn)以篩選出適合用于制備疫苗的、具有良好免疫原性的毒株。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)不同分離株之間的交叉免疫原性存在著一定的差異性，因此認(rèn)為通過(guò)研究毒株之間的交叉保護(hù)性以篩選出免疫原性更好的疫苗候選毒株是提高疫苗保護(hù)效力的有效途徑。

本研究用BJ23株H9亞型禽流感病毒制苗免疫雞后，不僅對(duì)同源毒株的攻擊提供了良好的保護(hù)，也可以有效抵御異源毒株的攻擊。表明BJ23株具有較好的交叉免疫原性與較廣的抗原保護(hù)譜，適合作為疫苗候選株用于疫苗研制。■

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收稿日期：2024-03-25