一株豬流行性腹瀉病毒的鑒定及S基因分析

摘要：為了解宜賓市豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的基因組特征，本試驗利用RT-PCR技術(shù)從腹瀉仔豬腸道內(nèi)含物中分離出一株感染宜賓市豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的株系，并將其命名為SCYB202212。通過RT-PCR方法對S基因進行擴增，對測序結(jié)果拼接并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明SCYB202212的S基因長度為4161 bp；系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，SCYB202212與CH-HeN-ZLH-2022，SXSL，S2021株處于同一獨立分支，屬于GⅡ-a亞型。本研究有助于深入了解宜賓市PEDV分離毒株的分子特性，為后續(xù)該病的診斷試劑和疫苗開發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；S基因；分子特性

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、傳染性腹瀉疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水和生長緩慢等癥狀，危害嚴(yán)重養(yǎng)豬業(yè)，尤其對哺乳仔豬危害更為嚴(yán)重，發(fā)病率高達100%，病死率高達80%[1]。1984 年中國首次報道該病[2]。2010 年我國暴發(fā)大面積PED 疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重損失[3-4]。PEDV屬于甲級冠狀病毒，是一種基因組長度為27～33 kb的單鏈RNA病毒。PEDV的纖突（S）蛋白是一種I型糖蛋白，由1 383個氨基酸構(gòu)成，具有促進中和抗體的生成的作用[5]。S基因是該病毒最主要的毒力基因，不同毒株的S基因存在多樣性。因此，了解PEDV的S基因?qū)α私庠摬《镜倪z傳特性、流行性、變異及疫苗開發(fā)等相當(dāng)重要[6-7]。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2021年 9月，在宜賓市的一家養(yǎng)豬場，發(fā)現(xiàn)了仔豬腹瀉情況嚴(yán)重的問題。為了研究發(fā)病原因，剖解了5只發(fā)病仔豬，并提取了其腸道內(nèi)容物進行分析。內(nèi)容物用無菌鹽水研磨（含雙抗，其中青霉素濃度為200 IU/mL，鏈霉素濃度為200 mg/mL），按照1：5的體積比，將研磨液反復(fù)凍融2～3次，最后一次取出置于4 ℃ 8 000 g離心10 min，取上清液，用于RNA提取和RT-PCR擴增。

1.2 試劑來源

RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA公司，DNA凝膠回收試劑盒購自天根生物科技有限公司，核酸測序在上海生物工程有限公司完成。

1.3引物設(shè)計與合成

本實驗室保存鑒定引物和S基因擴增引物，目的片段長度分別為671和4 161 bp，引物均由上海生物工程有限公司合成（見表1）。

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR

將樣品按照提取試劑盒說明書抽提總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為：dNTP mix 12.5 μL，RNasin酶抑制劑0.5 μL，引物各 0.5 μL，提取總RNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h，產(chǎn)物置于-70 ℃保存。

1.5 P CR檢測

PCR檢測的反應(yīng)體系為：Green Taq Mix 12.5 μL；PEDV-F 0.5 μL；PEDV-R 0.5 uL；模板2 μL，加ddH2O至25 μL。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳。

1.6 S基因擴增和測序

以病毒的 cDNA 為模板，進行PCR 擴增，反應(yīng)體系為：dNTP Mix 12.5 μL；S-F 1.0 μL；S-R 1.0 uL；模板 2 μL，加ddH2O至25 μL。擴增條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。之后對得到的目的片段進行純化回收，并將純化產(chǎn)物送至公司測序。

1.7 序列分析

應(yīng)用SeqMan軟件，將測序序列進行拼接。應(yīng)用MegAlign軟件，將PEDVS基因序列與GenBank上發(fā)表的39條PEDV毒株S基因參考序列（表2），進行比對分析，并用 Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)遺傳發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果

對腸道內(nèi)容物樣品進行PEDV檢測，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果擴增出671 bp的目的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致（圖1），說明臨床樣品存在PEDV的感染。

2.2 S基因的獲得

以病毒的cDNA為模板，進行PEDV的S基因擴增，得到與預(yù)期大小一致的目的條帶，將擴增的目的片段進行純化，并將純化后的產(chǎn)物進行測序。將測序結(jié)果與NCBI 上公布的PEDV參考株序列比對，確認得到了S基因的全長序列，并將其來源毒株命名為SCYB202212毒株。

2.3 S基因序列分析

應(yīng)用SeqMan軟件對SCYB202212毒株的S基因進行比對和拼接，結(jié)果顯示，SCYB202212毒株的S基因全長4161nt，編碼氨基酸1388個。應(yīng)用MegAlign軟件，將SCYB202212毒株的S基因核苷酸序列，與GenBank上發(fā)表的39株參考毒株的核苷酸序列進行同源性對比。結(jié)果表明，核苷酸同源性在92.4%（LZC）～99.8%（SC2021）（圖2）。并構(gòu)建S基因核苷酸的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。PEDV毒株有兩個明顯的分支，即GⅠ和GⅡ型，SCYB202212與國內(nèi)PEDV疫苗株CH-HeN-ZLH-2022、SXSL在同一個分支上，與CH-HeN-ZLH-2022、SXSL和SC2021毒株的遺傳距離較近。遺傳進化分析表明，SCYB202212屬于GⅡ-a變異毒株。

3 討論

自我國暴發(fā)PEDV以來，PEDV病毒對世界許多國家和地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的沖擊。本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增試驗，對四川宜賓市某規(guī)模場豬群腹瀉病例進行了診斷，綜合分析發(fā)現(xiàn)，本次疫病很可能是由PEDV感染引起的。疫病發(fā)生后果斷采取消滅傳染源、切斷病毒傳播途徑等措施能有效預(yù)防此病的發(fā)生。

S蛋白是PEDV關(guān)鍵毒力蛋白，該蛋白含有多個B細胞表位和抗體結(jié)構(gòu)域，主要介導(dǎo)膜融合進行細胞侵染，感染后可使機體產(chǎn)生中和抗體，致病機理是通過膜融合入侵到宿主細胞，S基因的突變能夠引起PEDV毒力的改變[7]。

本研究應(yīng)用 Mega 5.0 軟件，將分離到S基因與Gene Bank上39 條參考序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，分離毒株與CH-HeN-ZLH-2022，SXSL，SC2021遺傳關(guān)系較近，屬于PEDV GⅡ-a毒株。結(jié)果表明，本研究得到S基因的毒株為變異毒株。

目前采取的主要的防控措施：①加強飼養(yǎng)管理，做好豬場的日常清潔、消毒和生物安全防控措施，建立日常規(guī)范的消毒程序，做好飼養(yǎng)帶豬消毒和豬群出欄后的全面徹底消毒，在疫病高發(fā)季節(jié)，增加消毒頻次，開窗通風(fēng)，對進場人員、車輛、物品和飼料等也要進行消毒；②加強母豬管理，豬流行性腹瀉主要侵害對象是仔豬，健康的母豬能在一定程度上保障仔豬的健康，因此，在母豬生產(chǎn)過程中，控制好豬舍的溫度、濕度和營養(yǎng)，能保證仔豬的質(zhì)量；③疫苗接種，疫苗免疫是預(yù)防PEDV最有效的方式，目前，國內(nèi)市場多采取活疫苗+滅活疫苗的方式進行，通過疫苗接種可以使仔豬通過被動免疫獲得母源抗體，從而提高仔豬抗病能力，從根本上防止豬流行性腹瀉的發(fā)生。■

參考文獻：

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[7] 楊德強.豬流行性腹瀉病毒S基因在昆蟲細胞中的表達及其單克隆抗體的制備[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2017.

收稿日期：2023-09-07

基金項目：宜賓學(xué)院博士啟動項目（2019QD09，2019QD10） ；2020年四川省“天府萬人計劃”天府農(nóng)業(yè)大師項目。

作者簡介：潘延樂（1989— ），女，甘肅靖遠人，碩士研究生，獸醫(yī)師，從事動物疫病防控工作。1057744054@qq.com。

*通信作者：田志革，E-mail： beishugege@126.com；尹華江，E-mail：yinhuajiang6363@126.com。