波爾山羊精液保存條件的研究

摘要：本文對不同條件下、不同成分的稀釋液保存波爾山羊精液的效果進行了對比試驗。試驗證明在不同條件下原精的質量是影響波爾山羊精液保存效果的重要因素，加強種公羊的日常飼養管理，提升原精質量，對提高冷精受胎率有良好效果。

關鍵詞：波爾山羊；精液保存；凍后活力；維生素B12

波爾山羊系是1995年我國從德國引進的良種肉山羊，現在為了能充分利用種公羊的精液，一般會采取人工授精的方式進行配種，以最大限度地發揮其繁殖潛力。本實驗是室溫（37 ℃）和低溫（4～5 ℃）環境波爾山羊精液保存條件的試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用威海市榮成市俚島鎮成年波爾山羊種公羊4只，年齡分別為2、3、3、3周歲，體重分別為110、125、126和130 kg。無生殖系統疾病，健壯，發育正常，性機能良好。在適合配種時期4只種公羊轉為圈舍飼養，每日飼料中添加磷酸縮脲（80 g/kg）和鋅、硒等微量元素的配合精料890 g，新鮮樹葉、青干草等粗飼料采取自由采食方式飼喂。

1.2 精液

對試驗用4只波爾山羊種公羊，采集精液1次/d，連續采集2 d，7 d后重復該試驗。

1.3 稀釋液及解凍液的配制

1）37 ℃保存用稀釋液和4～5 ℃保存用稀釋液。

A液：葡萄糖3 g和檸檬酸鈉2 g加入雙重蒸餾水中混勻，然后加雙重蒸餾水，使溶液至90 mL，消毒后加入鏈霉素100 mg、青霉素100 000 IU、蛋黃液10 mL。

B液（37 ℃保存用稀釋液）：每毫升0.9％氯化鈉注射液中加青霉素1 000 IU、鏈霉素1 mL混勻。

C液：0.9％氯化鈉和5％葡萄糖注射液混合液（按1：1比例配制），每毫升加青霉素1 000 IU、鏈霉素 1 mL混勻。

D液：脫脂羊奶自制，每毫升脫脂羊奶中加青霉素1 000 IU、鏈霉素1 mL混勻。

E液（4～5 ℃保存用稀釋液）：VB12注射液（每支1 mL，含0.5 mg VB12），每毫升加青霉素1 000 IU、鏈霉素1 mL。

F液：A液加E液（按4：1比例配制）。

2）凍精稀釋液。

G液（基礎液）：取三羥基甲基氨甲烷1.84 g、檸檬酸1.00 g、檸檬酸鈉1.70 g、葡萄糖1.20 g，加入雙重蒸餾水中混勻，然后加雙重蒸餾水，使溶液至100 mL，消毒后備用。

一液：取85 mL G液（基礎液），加入蛋黃液15 mL、青霉素50 000 IU、鏈霉素50 mg后混勻備用；

二液：取28 mL一液，向其中加甘油3 mL混勻備用。

H液（基礎液）：葡萄糖、檸檬酸鈉各3 g，加入雙重蒸餾水中混勻，然后加雙重蒸餾水，使溶液至100 mL，消毒后備用。

一液：取80 mL H液（基礎液），加入蛋黃20 mL、青霉素50 000 IU、鏈霉素50 mg混勻備用；

二液：取22 mL一液，加入甘油3 mL混勻備用。

I液（基礎液）：取葡萄糖3.10 g、乳糖4.60 g、檸檬酸鈉1.50 g，加入雙重蒸餾水中混勻，然后加雙重蒸餾水，使溶液至100 mL，消毒后備用。

一液：取105 mL I液（基礎液），加蛋黃20 mL、青霉素50 000 IU、鏈霉素50 mg混勻備用；

二液：取25 mL一液，加入甘油2 mL混勻備用。

3）凍精解凍液。

自制2.9％檸檬酸鈉溶液。

VB12（每支1 mL，含0.5 mg VB12）。

2 方法

2.1 精液的采集和品質評定

精液采集方法：常規假陰道采精。

品質評定：精液采出后，通過肉眼觀察評定精液的顏色及混濁度；稀釋后通過顯微鏡觀測其密度和活力來判定其對試驗結果的影響。

2.2 精子的計數

需把鮮精和凍精均按照原精液做200倍稀釋后，然后滴到血球計數板上，并立即在400倍顯微鏡下觀察和記錄不運動的精子數，然后將計數板放置于50 ℃下10 min，殺死精子，觀察和記錄活動精子數，即為存活精子數。活精子數/總精子數=精子活力。

2.3 保存與解凍

1）鮮精在37 ℃條件保存。用5種稀釋液（ABCDE稀釋液）對原精進行10倍稀釋，然后把稀釋后的精液取相同體積分別裝在20個無菌玻璃容器中，置于37 ℃恒溫箱中保存。開始時每2 h檢查一次精子活力，然后根據精子活力降低，適當調整檢查間隔時間。記錄精子活力在0.3以上時的存活時間和99％的精子死亡為止所存活時間。

2）鮮精在4～5 ℃條件保存。用5種稀釋液（ACDEF稀釋液）來對原精進行10倍稀釋，然后把稀釋后的精液取相同體積分別裝在20個無菌玻璃容器中，置于4～5 ℃冰箱中保存。12～24 h后對其進行首次檢查，其后根據具體情況，適當調整檢查間隔時間。

3）鮮精的冷凍保存。首先將每份原精分別用3種（G、H、I液）等溫一液按1∶1.5倍稀釋，放入無菌玻璃容器中，然后把玻璃容器用紗布包裹15層，置于4～5 ℃冰箱中2 h，再分別加入與一液等量的二液進行等溫稀釋，平衡15～20 min，最后用液氮滴凍成顆粒。

4）冷精的解凍。解凍試驗共分兩組，一組是在37 ℃條件下進行解凍，另一組是在4～5 ℃條件下進行解凍；首先在每一組的兩個解凍管里分別加入VB12注射液1 mL、2.9％檬酸鈉1 mL，然后與干解凍管（共六管）一起豎立放置于40 ℃水浴鍋中預熱，再在每個試管中加入6顆冷精顆粒，輕搖至2/3溶化時，從水浴鍋中取出繼續輕搖至其全部溶化。解凍后的精液經電子顯微鏡檢測并計算和記錄下每組在不同解凍條件下的精子活力，然后把解凍后的精液分別裝入無菌玻璃容器中，置于37 ℃恒溫箱或4～5 ℃冰箱內保存，觀察并記錄每個管中精子活力在0.3以上時的存活時間和99％的精子死亡時所存活時間。

2.4 配種實驗

用四號種公羊的凍精經干解凍法解凍的波爾山羊精液對一組30只普通母山羊進行人工授精，用VB12解凍的波爾山羊精液對另一組30只普通母山羊進行人工授精；8～12 h后各組重復輸精一次。

3 結果

3.1 精液質量

每次采精量為0.8～1.5 mL，精液外觀呈濃稠的乳白色，無異常氣味，pH=6.8；在低倍顯微鏡下觀察，可見似云霧狀翻騰滾動，其精液活力均穩定在0.9，精子密度為19.0～31.5億個/mL。

3.2 鮮精在37 ℃條件下保存

鮮精在37℃條件下保存結果見表1。

根據表1結果，A、B、C、D、E五種稀釋液均可用于新鮮精液保存，在37 ℃條件下，通過比對試驗會發現E液（VB12注射液）保存效果最好，精子較其他活力更高，但存活時間比A液短；B液和D液的保存效果較差。

同時此試驗還會發現在37 ℃條件下，五種稀釋液有相同的規律，原精活力越好，精子的存活時間越長。

3.2 鮮精在4～5 ℃條件下保存

鮮精在4～5 ℃條件下保存結果見表2。

由表2數據可見，在4～5 ℃條件下，鮮精保存效果由高到低依次為A液、D液、F液、C液、E液。同時此試驗還會發現在低溫（4～5 ℃）條件下，五種稀釋液有相同的規律，原精活力越好，精子的存活時間越長。

3.3 冷凍保存與解凍

冷凍保存和解凍后精子活力結果見表3和表4。

由表3數據可見，H液和I液較理想，但原精質量對冷凍效果影響很大。

由表4數據可見，VB12解凍效果最好，而干解凍效果最差。

3.4 配種試驗結果

用VB12注射液解凍精液對母羊30只進行人工授精，24只懷孕，受胎率80％，而用干解凍精液對母羊30只進行人工授精，16只懷孕，受胎率53％，明顯看出用VB12注射液解凍精液的受胎效果更好。

4 結論

4.1 鮮精的室溫（37 ℃）與低溫（4～5 ℃）保存

波爾山羊精液室溫保存在生產中稀釋液常用生理鹽水、脫脂牛羊奶和三基緩沖液[2] 。但本試驗將糖鹽水和VB12用于波爾山羊精液室溫保存，取得了較好效果。在37 ℃條件下，用VB12注射液稀釋的原精能夠使精子保持長時間的高活力。

4.2 冷凍及解凍后精液保存

在日常生產中，常用2.9%的檸檬酸鈉作為動物凍精的解凍液。之前，有人將VB12注射液用于牛凍精解凍效果較好[3-5]。從本試驗研究看，將VB12用于山羊凍精顆粒解凍，效果同樣十分理想。而且與干解凍和2.9%檸檬酸鈉相比，用VB12解凍的精液不但活力旺盛，而且在室溫和低溫條件下的保存時間延長，在低溫條件下的有效存活時間也延長了。因此VB12注射液可推薦為波爾山羊凍精解凍液。■

參考文獻：

[1] 周占琴.良種肉用羊——布爾山羊簡介[J].草食家畜，1994（3）：6.

[2] 中國科學技術情報研究所重慶分所.家畜繁殖技術進展[M].科學技術文獻出版社重慶分社，1979.

[3] 李潤生，郭玉香.維生素B12注射液可作黃改顆粒精液解凍液[J].黃牛雜志，1989（2）：82.

[4] 趙懷廉，趙光遠.維生素B12作解凍液能提高母牛受胎率[J].黃牛雜志，1993（3）：40-41.

[5] 李玉凡，李茂林.維生素B12注射液解凍牛的凍精試驗[J].當代畜牧，1996（5）：13.

收稿日期：2023-10-13