帶魚酶解工藝研究及海鮮調味汁的制備

摘要：文章以帶魚為研究對象，通過酶解作用制備海鮮調味汁。以水解度（DH）為評價指標，研究了不同種類的蛋白酶對酶解效果的影響，并通過正交試驗對酶解工藝參數進行優化，確定最佳工藝條件。結果表明，風味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解效果較好。最佳工藝條件為酶解溫度60 ℃、復配比例2∶1、酶添加量1 000 U/g底物、酶解時間3.5 h。利用酶解液制備的海鮮調味汁中必需氨基酸和鮮味氨基酸含量較高，帶魚香味濃郁，鮮香味明顯，無明顯雜質，有作為具有特色風味的調味汁的潛力。

關鍵詞：帶魚；酶解作用；工藝；正交試驗；海鮮調味汁

中圖分類號：TS201.1 """""文獻標志碼：A """"文章編號：1000-9973（2024）09-0109-05

Study on Enzymatic Hydrolysis Process of Hairtail and

Preparation of Seafood Sauce

WANG Ran1， FENG Xin-rui1， FAN Wen2， WU Tao-an1，

ZHANG Bao1， ZHOU Hui1， CAI Ke-zhou1*

（1.Key Laboratory of Green Manufacturing and Resource Exploration of Animal-derived Food

in Anhui Province， Hefei University of Technology， Hefei 230009， China; 2.Zhengzhou

Synear Food Co.， Ltd.， Zhengzhou 450003， China）

Abstract： In this paper， with hairtail as the research object， seafood sauce is prepared through" enzymatic hydrolysis. With the degree of hydrolysis （DH） as the evaluation index， the effects of different types of proteases on the enzymatic hydrolysis effect are studied， and enzymatic hydrolysis process parameters are optimized through orthogonal test， in order to determine the optimal process conditions. The results indicate that flavor protease and neutral protease have better enzymatic hydrolysis effects. The optimal process conditions are enzymatic hydrolysis temperature of 60 ℃， compound ratio of 2∶1， enzyme addition amount of 1 000 U/g substrate and enzymatic hydrolysis time of 3.5 h. The seafood sauce prepared using the enzymatic hydrolysate has higher content of essential amino acids and umami amino acids. The sauce has rich hairtail aroma， clear umami aroma and no obvious impurities， indicating that it has potential as sauce with characteristic flavor.

Key words： hairtail; enzymatic hydrolysis; process; orthogonal test; seafood sauce

收稿日期：2024-03-07

基金項目：“十四五”國家重點研發計劃課題（2021YFD21002）

作者簡介：王冉（1998—），女，碩士，研究方向：食品現代加工理論與方法。

*通信作者：蔡克周（1980—），男，教授，博士，研究方向：肉品加工與質量控制。

中國是世界上最大的帶魚生產國之一，中國各個沿海省份都有著豐富的帶魚資源[1]。帶魚種類繁多，作為我國重要的魚類之一，其肉質細嫩，深受消費者的喜愛。帶魚是一種蛋白質含量（17.57%）和脂肪含量（5.16%）較高的魚類，同時還含有多種人體所需的營養成分，例如礦物質、維生素、不飽和脂肪酸等[2-3]。然而，長期以來，由于帶魚市場價格低，加工技術水平和回收手段落后，滯銷的帶魚大多僅用于加工生產飼料、魚粉等，導致產品的利用率不高、經濟效益低，并且存在嚴重的資源浪費等現象[4-6]。因此，如何提高帶魚的附加值和資源利用率已成為現在研究的熱點之一，開展此類研究能夠為帶魚的深度利用提供理論基礎和參考依據。

目前，海鮮調味料作為一種特有的風味調料制品，已經成為人們餐桌上不可或缺的調味品之一[7]。制備海鮮調味料的方法主要包括酶解法和微生物發酵法[8-10]。其中，利用酶解法制備海鮮調味汁已經得到廣泛的應用和研究。Peinado等[6]發現酶解后的魚粉釋放出大量的呈味氨基酸，尤其是谷氨酸、賴氨酸。Zhang等[11]發現酶解海帶后制備的海鮮調味品中含有豐富的氨基酸，主要呈現鮮味和咸味，這些結果表明酶解法在海鮮調味制品的制備中具有較大的潛力。目前，國內外對帶魚的研究多集中在生物活性肽、金屬螯合物等方面，而以帶魚為原料制備調味汁的報道較少。因此，本研究旨在通過酶解法制備具有帶魚特色風味的海鮮調味汁，以提高帶魚的深加工利用價值并為新型海鮮調味品的開發提供一定的技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

冰鮮帶魚：購于合肥大潤發超市翡翠店；風味蛋白酶（2×104 U/g）、堿性蛋白酶（2×105 U/g）、中性蛋白酶（5×104 U/g）、復合蛋白酶（1.2×105 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；鄰苯二甲醛（分析純）：上海畢得醫藥科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純）：上海科雅生物科技有限公司；二硫蘇糖醇（DTT，分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-絲氨酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T18型高速均質機 德國IKA集團；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；Synergy H1型酶標儀 美國BioTek儀器有限公司；SZCL-2恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；SB-5200D超聲波清洗機、Scientz-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司；HH-4X型恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；S-433D全自動氨基酸分析儀 德國Sykam公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 帶魚酶解液的制備

將帶魚進行預處理，去除魚骨、魚鰭、內臟等，清洗干凈，瀝干水分后，分裝并密封于－20 ℃冰箱中保存備用。

工藝流程：向預處理后的帶魚肉中按一定的料液比（1∶5）加入超純水，混合均勻后，經8 500 r/min均質勻漿2 min后，添加適量的蛋白酶，在一定溫度下進行酶解；酶解結束后，于80～90 ℃水浴鍋中滅酶10～15 min，冷卻后，在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，棄沉淀，即為待測酶解液。

1.3.2 蛋白酶的篩選

選取風味蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，料液比為1∶5，酶添加量為400 U/g底物，于各自最適條件下進行酶解。以水解度（DH）為篩選指標，篩選出兩種效果最佳的蛋白酶進行后續酶解條件優化試驗。

1.3.3 單因素試驗設計

以酶解液的水解度為指標，在保證其他因素相同的情況下，考察酶解時間（2.5，3，3.5，4，4.5 h）、酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）、酶添加量（400，600，800，1 000，1 200 U/g底物）、復配比例（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）4個因素對酶解液水解度的影響，進而篩選出最佳條件。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，研究風味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解溫度、復配比例、酶添加量、酶解時間對酶解效果的影響，以水解度為指標，進行四因素三水平L9（34）正交試驗，進一步確定最佳水解工藝條件，正交試驗因素及水平設計見表1。

1.3.5 水解度（DH）

水解度（degree of hydrolysis，DH）是指蛋白質中肽鍵被酶裂解的百分比，可用來衡量蛋白質被酶解的程度。以絲氨酸作為標準品，采用OPA法對帶魚酶解液進行水解度的測定[12-13]。水解度（DH）計算公式如下：

DH=Serine-NH2-βα·htot×100%。

式中：Serine-NH2為每克蛋白中絲氨酸氨基的毫摩爾數（mmol/g）；htot為每克蛋白中所含的總肽鍵數（mmol/g），帶魚的htot為8.17 mmol/g[14]；α、β分別為常數1，0.4[12]。

1.3.6 帶魚海鮮調味汁的制備

在酶解液中加入1％白砂糖、1.5％食用鹽、0.5％味精、0.2％檸檬酸進行調配。將加入輔料的酶解液混合均勻，即為帶魚海鮮調味汁。

1.3.7 游離氨基酸的測定

對海鮮調味汁進行游離氨基酸含量的測定，測定方法參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

1.3.8 感官評價

感官評定小組由6名食品質量與安全和食品科學與工程專業的學生組成，其中男生3名，女生3名，年齡均在22～26歲。在正式參與評價前，6名感官評定人員分別對樣品的肉香味、甜味、鮮味、咸味、苦味等進行了訓練以區分不同的味道和特征。每次評價之前漱口30 s，隨后在昏暗的條件下進行感官描述。

1.4 數據統計

所有數據均平行3次，結果表示為平均值±標準差。運用統計軟件Origin 8.0、SPSS 26.0進行數據的處理和分析，顯著性水平為Plt;0.05。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

本研究選取了4種蛋白酶，包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶和復合蛋白酶。以絲氨酸做標準曲線，見圖1。測定了不同蛋白酶酶解帶魚后酶解液的水解度（DH），結果見圖2。

由圖2可知，不同蛋白酶對帶魚的酶解效果有顯著差異。風味蛋白酶、復合蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶對應的水解度依次為20.59%、10.73%、6.84%、11.17%，其中風味蛋白酶水解帶魚蛋白的能力最強，表明經過風味蛋白酶的酶解作用，更多的小分子物質如多肽被釋放出來[15]。風味蛋白酶的酶解效果最強，說明風味蛋白酶可能更適合酶解帶魚蛋白，其次是中性蛋白酶和復合蛋白酶。因此，選擇風味蛋白酶和中性蛋白酶作為酶解帶魚的最適蛋白酶。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 復配比例對酶解效果的影響

復配比例（風味蛋白酶∶中性蛋白酶）對帶魚酶解效果的影響見圖3。

由圖3可知，隨著風味蛋白酶比例的減小，水解度呈現先上升后下降的趨勢。當中性蛋白酶的比例不斷增大時，水解度呈現相同的變化趨勢。在復配比例為2∶1（風味蛋白酶∶中性蛋白酶）時，水解度達到峰值（32.53%），這是由于蛋白酶的酶切位點不同，不同的酶復配有助于起到互補的效果，進而促進肽鍵的斷裂和短肽的生成，水解度升高[16]。因此，選擇2∶1作為酶解的最適復配比例。

2.2.2 酶添加量對酶解效果的影響

酶添加量對酶解效果的影響見圖4。

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，水解度整體呈現先上升后下降的趨勢。當酶添加量從400 U/g底物增加到1 000 U/g底物時，水解度顯著上升，當酶添加量為1 000 U/g底物時，水解度達到最大值，為32.91%。而當酶添加量超過1 000 U/g底物時，水解度呈現下降趨勢，這可能是由于酶添加量過多導致酶解物進一步分解。因此，選擇1 000 U/g底物為最佳酶添加量。

2.2.3 酶解時間對酶解效果的影響

酶解時間對酶解效果的影響見圖5。

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，水解度呈現先升高后降低的趨勢。當酶解時間從2.5 h增加到3 h時，帶魚蛋白的水解度逐漸上升，從27.62%上升到32.69%，達到最大值。當酶解時間從3 h延長到4.5 h時，水解度逐漸降低，從32.69%降低至27.44%，并且下降的速度逐漸緩慢，這可能是因為短時間內酶與底物充分結合，使得水解度升高，而時間過長，底物逐漸減少，酶與底物結合時可能會產生競爭性抑制作用，從而導致水解度呈現下降趨勢[17]。因此，選擇3 h作為最佳酶解時間。

2.2.4 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對酶解效果的影響見圖6。

由圖6可知，隨著酶解溫度的升高，水解度逐漸升高；當酶解溫度達到55 ℃時，水解度達到最大值，為36.85%。當酶解溫度超過55 ℃后，水解度下降，這可能是因為酶解溫度過高抑制了酶的生物活性，從而降低了對底物的水解能力。因此，選擇55 ℃作為最適酶解溫度。

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選取酶解溫度、復配比例、酶添加量、酶解時間4個因素，取各單因素試驗中3個較優水平，按照表1進行正交試驗，正交試驗方案設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

由表2中極差分析可知，對帶魚酶解效果影響的因素主次順序為酶解溫度gt;酶添加量gt;酶解時間gt;復配比例。由表3中方差分析可知，酶解溫度和酶添加量對酶解效果的影響極顯著，而復配比例和酶解時間對酶解效果的影響顯著。表2中第9號試驗結果最好，其最優組合為A3B3C2D1。而根據計算分析可得最優組合為A3B2C2D3。在A3B2C2D3條件下測得的水解度為42.39%。因此，采用酶添加量1 000 U/g底物、復配比例（風味蛋白酶∶中性蛋白酶）2∶1、酶解溫度60 ℃、酶解時間3.5 h作為反應條件制備酶解液。

2.4 海鮮調味品綜合評價

2.4.1 游離氨基酸組成和含量分析

游離氨基酸對酶解產物的風味特性具有重要影響[18]。海鮮調味汁中游離氨基酸的組成和含量見表4。

由表4可知，酶解液中主要的氨基酸為谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。必需氨基酸（Lys、Phe、Met、Thr、Ile、Val、His、Leu）含量占58.59%，占比較高。在必需氨基酸中，亮氨酸含量最高，為（4.47±0.01） g/100 g，其次是苯丙氨酸，含量為（3.15±0.02） g/100 g。鮮味氨基酸（Glu、Asp）占比為12.08%，其中谷氨酸含量為（3.00±0.04） g/100 g，僅次于異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸，并且鮮味氨基酸含量高，有助于促進產品鮮味的產生，為成品提供鮮香風味。

2.4.2 感官評價

由表5可知，經過感官評價后，發現利用酶解液制備的海鮮調味汁呈現濃郁的帶魚香味，鮮味和咸味較明顯，其次是甜味，苦味較弱。觀察形態發現，無沉淀、不溶物存在，且顏色鮮亮有光澤。因此，上述結果表明采用優化后的工藝制備的酶解液有作為海鮮風味調味汁的潛力。

3 結論

本文以水解度作為篩選指標，通過試驗篩選出酶解帶魚的兩種最優酶（風味蛋白酶和中性蛋白酶），并運用單因素試驗、正交試驗確定了帶魚酶解液制備的最佳工藝條件：酶解溫度60 ℃、復配比例2∶1、酶添加量1 000 U/g底物、酶解時間3.5 h，此條件下酶解液的水解度達到42.39%。經過游離氨基酸測定發現，利用最優條件下得到的酶解液制成的海鮮調味汁中鮮味氨基酸含量較高，其中谷氨酸含量僅次于異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸。必需氨基酸含量占比58.59%，營養價值較高。感官評價結果顯示，調味汁咸鮮味適中，具有帶魚特有的香氣，無刺激性味道，無肉眼可見的雜質。該研究結果為提高帶魚的深加工提供了參考，也為酶解制備海鮮調味汁這一思路提供了理論依據。

參考文獻：

[1]常雨晴.帶魚多肽制備及美拉德反應對其性質影響研究[D].大連：大連海洋大學，2023.

[2]李邰宇，閻瑩瑩，應曉國，等.帶魚魚油的提取及理化特性研究[J].浙江海洋大學學報（自然科學版），2023，42（1）：20-28.

[3]李遠慧，鄭霖波，謝超，等.帶魚蛋白抗菌肽抑菌效果的影響因素[J].食品研究與開發，2022，43（20）：66-72.

[4]盧艷慧，李迎秋.帶魚蛋白酶解工藝條件的響應面優化[J].輕工學報，2020，35（4）：23-33.

[5]張曉敏.帶魚下腳料水解蛋白的制備及其利用研究[D].重慶：西南大學，2008.

[6]PEINADO I， KOUTSIDIS G， AMES J. Production of seafood flavour formulations from enzymatic hydrolysates of fish by-products[J].LWT-Food Science and Technology，2016，66：444-452.

[7]陳曉婷，吳靖娜，蘇永昌，等.海鮮調味品的種類及研究進展[J].漁業研究，2018，40（2）：163-168.

[8]劉鵬莉，遇艷萍，王晶，等.酶解聯合美拉德反應制備具有抗氧化活性的扇貝裙邊調味基料[J].食品安全質量檢測學報，2022，13（23）：7708-7714.

[9]徐劉貝，馬佳雯，蔡金秀，等.酶解-發酵法制備魚鮮汁的工藝優化[J].食品工業科技，2021，42（22）：185-192.

[10]李鑫，辛松林.響應面優化復合酶酶解羅非魚下腳料制備海鮮風味調味液[J].中國調味品，2023，48（7）：88-90，110.

[11]ZHANG X Y， JIANG D， LI D M， et al.Characterization of a seafood-flavoring enzymatic hydrolysate from brown alga Laminaria japonica[J].Journal of Food Measurement and Characterization，2019，13（2）：1185-1194.

[12]NIELSEN P， PETERSEN D， DAMBMANN C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis[J].Journal of Food Science，2001，66（5）：642-646.

[13]林虬，黃薇，宋永康，等.棉籽蛋白水解物水解度3種測定方法的比較[J].福建農業學報，2011，26（6）：1076-1080.

[14]林慧敏.帶魚下腳料酶解小肽亞鐵螯合物結構鑒定及其生物活性研究[D].福州：福建農林大學，2012.

[15]ZHENG Z L， ZHANG M， LIU W C， et al. Effect of beef tallow， phospholipid and microwave combined ultrasonic pretreatment on Maillard reaction of bovine bone enzymatic hydrolysate[J].Food Chemistry，2021，377（8）：131902.

[16]張夢雪，葉靜靜，高子鑫，等.雙酶法制備條斑紫菜酶解液工藝優化及抗氧化、抗疲勞活性研究[J].中國調味品，2023，48（7）：7-13.

[17]桂海佳，李江龍，李澤林，等.基于雙酶水解優化牛肉酶解液工藝及其呈味成分分析[J].中國調味品，2022，47（10）：103-109.

[18]ZHOU X， CUI H P， ZHANG Q， et al. Taste improvement of Maillard reaction intermediates derived from enzymatic hydrolysates of pea protein[J].Food Research International，2021，140：109985.