摘要：隨著人參種植年限的增加，土壤中自毒物質的積累會導致連作障礙的發生，極大地影響人參種植業的健康發展。生物降解土壤中自毒物質是緩解連作障礙的有效途徑。以酚酸類自毒物質為篩選指標，從人參根際土壤中分離、篩選酚酸類自毒物質降解細菌，結合16S rRNA基因測序及生理生化試驗對降解菌株進行分類鑒定，采用紫外分光光度法測定其降解能力，并進一步采用單因素試驗對其培養條件進行優化，利用降解菌對酚酸脅迫下的人參種子進行生防研究。結果表明，從人參根際土壤中分離出10株自毒物質降解菌，以假單胞菌屬（Pseudomonas）為主。初步降解試驗顯示菌株S1對水楊酸的降解率最高，達65.32%，經鑒定該菌株為伯克霍爾德屬（Burkholderia）細菌。單因素試驗結果表明，以硝酸鈣作為氮源，培養溫度30 ℃，500 mg·L?1自毒物質下，菌株S1的降解率達88.58%，較優化前明顯提升。生防試驗結果表明，菌株S1可緩解水楊酸對人參種子生長的抑制作用，促生效率達12.56%。綜上所述，從土壤中分離出可降解水楊酸的伯克霍爾德屬菌株S1具有較好的生防效果，對于解決連作障礙問題具有潛在生防應用價值。

關鍵詞：酚酸降解菌；自毒物質；人參；連作障礙；條件優化

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0651

中圖分類號：S47 文獻標志碼：A 文章編號：1008?0864（2024）07?0147?09

五加科多年生植物人參（Panax ginseng C. A.Meyer）屬名貴中藥材，具有極高的藥用和經濟價值[1?2]。人參在種植過程中存在嚴重的連作障礙現象，采收后10～20年內不能再次栽種，否則會出現燒須、爛根、病害多發、產量降低等，嚴重制約人參產業的可持續發展。導致連作障礙的原因主要是土壤理化性質的改變、土壤微生物群落結構失衡和自毒物質的積累，其中自毒物質被視為連作障礙的主要誘因[3]。人參在生長過程中，枯枝殘葉和根系分泌產生的自毒物質極易在土壤中積累，并產生化感作用，從而抑制種子萌發、破壞根系或其他分生組織，影響植物、土壤和微生物之間的相互作用，導致植物產生連作障礙[4?5]。李自博[6]從人參根際土壤中共收集鑒定出水楊酸、沒食子酸、苯甲酸、3-苯基丙酸和肉桂酸5種酚酸物質，被證明是人參連作障礙中根系分泌的主要化感物質，其中水楊酸含量最高，為0.519 mmol·L?1。He等[7]從西洋參土壤中分離出9種酚酸類化合物，土壤中約含1 200 mg·kg?1酚酸物質。本課題組前期在林下連作種植參根際土壤中檢測出苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸共8種酚酸類自毒物質[8]。

目前，解決連作障礙的主要防治手段是化學防治，依靠農藥進行土壤消毒。該方法存在化學藥劑毒性高、殘留超標等問題，嚴重影響生態環境安全[9]。因此，生物防治成了解決連作障礙的突破點。國內對于藥用植物自毒物質降解的研究主要集中在三七上，向維等[10]從三七根際土壤中成功分離出8株自毒物質降解細菌，其中編號SC3 的寡養單胞菌屬菌株具有消除連作土壤中皂苷類自毒物質的潛力；王羅濤等[11]發現，蒙氏假單胞菌PM-41 既能有效降解三七皂苷類自毒物質，又能有效拮抗三七銹腐病菌毀滅柱孢菌。在其他作物如花生（Arachis hypogaea L.）[12]、番茄（Solanum lycopersicum L.）[12]等中也發現有降解菌。毛寧等[14]發現了4 株對對羥基苯甲酸有明顯降解作用的放線菌，可有效降低草莓的死亡率和發病率。肖蓉等[15]發現，綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）能有效緩解羥基苯甲酸對黃瓜生長的抑制作用。但目前篩選得到的具有降解人參自毒物質功能菌的數量有限，且對于降解水楊酸等在土壤中積累含量較多的酚酸類自毒物質的降解菌研究還不夠透徹，其菌種資源有待進一步開發。

本研究根據前期試驗結果[8]，以土壤中檢測到的苯甲酸、阿魏酸、水楊酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、對羥基苯甲酸、沒食子酸8種酚酸類自毒物質作為研究目標，以人參連作土壤為材料，篩選具有降解能力的微生物菌株，確定降解菌的系統分類學地位，并優化高效降解菌的培養條件，考察自毒物質對人參種子的抑制作用及其高效降解菌的解毒能力，為綠色菌肥的研發應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤

供試土壤采自吉林省臨江市螞蟻河鄉三棚湖村（41°51′02.80\"N，127°6′21.81\"E，海拔833 m），采用五點采樣法，所選區域去表層10 cm土后，采集人參根際土并混勻。

1.1.2 供試種子

供試的人參種子購買于遼寧省沈陽市長白山參鄉產地，品種為長白山人參。選取顆粒飽滿、大小一致、無機械損傷的種粒備用。

1.1.3 主要試劑和儀器

水楊酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、沒食子酸、鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、瓊脂粉購自上海麥克林生化科技有限公司。CaCl2、K2HPO4、（NH4）2SO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O購自廣東光華科技股份有限公司。生理生化試劑盒及草酸銨結晶紫染液、草酸銨、盧戈氏碘液、沙黃復染液、對二甲基氨基苯甲醛、體積分數為95%酒精、濃鹽酸、甲基紅、質量濃度為40%的KOH 溶液、體積分數為6%的α?奈酚酒精溶液、對氨基苯磺酸、α?萘胺、乙酸購自杭州微生物試劑有限公司。試驗所需培養基及其配方如表1所示。

主要儀器包括ZHJH-C1106B 型超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）、G154DP型全自動立式高壓滅菌鍋[致微（廈門）儀器有限公司]、SP-1920紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、RE-2000B 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解菌分離篩選及分子鑒定

分別稱取3個采樣點各10 g土壤樣品混合，加入90 mL無菌水，置于恒溫搖床（220 r·min?1，28 ℃）振蕩過夜。分別在100、500和1 000 mg·L?1 酚酸作為單一碳源的篩選培養基中加入5 mL 土壤懸液，28 ℃、220 r·min?1 搖床培養3 d，連續培養3 個周期共9 d，接種量為2%。富集培養的菌液進行梯度稀釋（10?3、10?4、10?5），涂布于篩選培養基（酚酸物質1 000 mg·L?1）固體平板上，在分離篩選過程中設置空白組對照。挑選在以酚酸作為單一碳源的培養基上生長，而在其他培養條件相同卻無酚酸的培養基上不生長的菌株，初步確定為具有降解能力的降解菌株。反復劃線以得到菌株純培養物，純化后的單菌落收集于30%甘油中，置于?20 ℃冰箱保存。

形態學觀察：將降解菌株在LB培養基上劃線，28 ℃下培養24 h，觀察記錄菌落形態、顏色及透明度等特征。降解菌株的生理生化反應測定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[16]和《伯杰細菌鑒定手冊》[17]。

基因測序：超凈臺收集單菌落于1.5 mL離心管中，然后加入100 μL 10% 的Chelex-100 溶液，提取DNA。以基因組DNA 為模板，使用引物27F和1492R擴增16S rRNA基因片段。使用通用引物Eu-27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和Eu-1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）分別擴增細菌16S rRNA基因序列。PCR體系50 μL，包含 DNA模板2 μL、2×Taq Mastr Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 21 μL。PCR程序： 95 ℃預變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，32個循環；72 ℃充分延伸2 min，于4 ℃保存。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）進行序列比對。用MEGA 6.0中的neighbor-joining算法（自展數為1 000）構建系統進化樹。

1.2.2 降解菌降解能力測定

采用紫外分光光度計測定降解率，設置0～640 mg·L?1 酚酸等梯度含量，以酚酸含量為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。種子液在搖床（28 ℃，220 r·min?1）培養3 d后，放入50 mL離心管10 000 r·min?1離心10 min，棄上清收集菌體，用無菌水重懸至OD600=1.0。按重懸液2%的體積接種到篩選培養基（酚酸含量為1 000 mg·L?1）中搖床（28 ℃， 220 r·min?1）培養3 d。將發酵液裝入分液漏斗中，用二氯甲烷按照1∶2比例萃取3次，收集有機液相于旋蒸瓶中，在旋轉蒸發儀（30 ℃，80 r·min?1）上進行旋蒸濃縮后，將濃縮物轉移至樣品瓶內，用75%無水乙醇定容于5 mL。采用紫外分光光度儀測定，根據標準曲線得出剩余酚酸物質的量，按公式（1）計算降解率（degradation rate，DR）。

DR =（ D - M／D） ×100% （1）

式中，D 為經標準曲線計算得出對照組剩余酚酸物質的質量；M 為經標準曲線計算得出試驗組剩余酚酸物質的質量。

1.2.3 單因素試驗

選取溫度、酚酸含量、氮源3種因素進行單因素試驗，其他培養條件不變。溫度單因素試驗中將溫度分別設置為25、30、35、40 ℃；酚酸含量單因素試驗中將化感物質初始含量分別設置為100、500、1 000、1 500、2 000 mg·L?1；氮源單因素試驗中將氮源分別設置為磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、硝酸鉀（KNO3）、硫酸銨[（NH4）2SO4]、氯化銨（NH4Cl）、硝酸鈣[（Ca（NO3）2]。降解率的測定方法同1.2.2。

1.2.4 種子萌發試驗

分別選用無菌水（CK）、250 mg·L?1 水楊酸溶液（SA250）、2.5 mg·L?1 水楊酸溶液（SA2.5）、0.025 mg·L?1 水楊酸溶液（SA0.025）、降解菌液（SA250+S1）處理人參種子，處理液用量均為4 mL，共計5種處理。其中降解菌液處理為降解菌和250 mg·L?1 水楊酸（1∶3）的混合液4 mL。混合液中的降解菌為前期篩選得到，經液體搖床發酵（1.2.3優化后的發酵條件）培養3 d后，去除上清液，采用去離子水稀釋至OD600=1，即成降解菌液。

培養皿法： 在9 cm 玻璃培養皿的底部鋪2層濾紙，將濾紙片用無菌水浸透固定，高壓蒸汽滅菌（121 ℃、10 min）。選取顆粒飽滿、大小均一的裂口人參種子，用4%的次氯酸鈉消毒5 min，再用無菌水反復沖洗數次后移至超凈工作臺，每個培養皿放入10粒人參種子和4 mL處理液，每組設置2組重復。

種子萌發形態指標測定： 放入種子記作第1天，之后每天觀察生長情況。于第7天統計并測量記錄各處理種子的生長情況。種子平鋪于透明硬塑料膜上，用游標卡尺準確測量胚根長度和胚軸長度，并計算化感作用效應指數（responseindex，RI）[18]。當Tgt;C 時，采用公式（3）計算RI；當T

胚根（胚軸）生長值=7 d后的胚根（胚軸）長-剛種植的胚根長（胚軸）長（2）

RI = 1 - C／T（3）

RI = T／C- 1 （4）

式中，C 為空白組生長值，T 為處理組生長值；當RIgt;0時，表現為促進作用；當RIlt;0時，表現為抑制作用；絕對值的大小表示自毒作用強度。

1.3 數據處理

采用Excel 2018軟件進行試驗數據的整理；采用SPSS對數據進行方差分析及最小顯著差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 降解菌分離篩選結果

以水楊酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、肉桂酸、沒食子酸、鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸為單一碳源，從土壤樣品中共分離得到10株細菌，包含1株放線菌。各菌株的外觀形態如圖1所示。MSZ為放線菌，呈白纖毛球狀；其余均為細菌，顏色大都為黃白色，表面光滑，粘稠狀。14XC、BH2XC在香草酸篩選培養基上生長；19AW、BH1AW在阿魏酸篩選培養基上生長；D2在對羥基苯甲酸篩選培養基上生長；DXH1在丁香酸篩選培養基上生長；L1在鄰苯二甲酸篩選培養基上生長；RG1在肉桂酸篩選培養基上生長；S1在水楊酸篩選培養基上生長；放線菌MSZ 在沒食子酸篩選培養基上生長。基于16SrRNA序列比對結果如表2所示。S1與伯克霍爾德菌（Burkholderia FNTGs）的相似度達100%。

降解能力測定結果（表3）表明，S1為高效降解水楊酸菌株。對S1 進行形態學觀察發現，其在篩選培養基上的生長狀況良好，具有粘度、外觀呈圓形有閃光；革蘭氏染色結果為陰性；甲基紅試驗、V-P 試驗、氧化?發酵試驗、尿素酶試驗反應呈陽性；革蘭氏染色、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗反應呈陰性。

以降解菌株S1的DNA為模板，利用細菌16SrRNA 基因通用引物進行PCR 擴增，其產物為1 120 bp 的基因片段。將其通過EzBioCloud 和NCBI進行比對，結果（圖2）顯示，降解菌株S1與伯克霍爾德菌（Burkholderia FNTGs）處于同一分支，最大相似度為99%，結合菌株形態學特征和生理生化檢測，將菌株S1鑒定為伯克霍爾德菌屬。

2.2 降解能力測定結果

經搖床發酵，通過標準曲線分別計算菌株S1對酚酸類物質的降解能力，結果（表4）表明，有6株表現出較好的降解能力，其中菌株S1對水楊酸的降解效果最強，平均降解率達65.32%。由于人參連作土壤中水楊酸的含量較高[3]，而S1對水楊酸的降解能力最優，因此選取菌株S1進行后續應用研究。

2.3 菌株S1 培養條件的優化

考察在以水楊酸為單一碳源的篩選培養基中，不同氮源。培養溫度和自毒物質含量對菌株S1降解水楊酸的影響。結果表明，不同因素對降解率影響存在顯著差異。不同氮源培養條件下，硝酸鈣[Ca（NO3）2]的效果最好，菌株S1對水楊酸的降解率達到81.4%（圖3），顯著高于其他氮源。菌株S1對培養溫度具有良好的耐受性，在25～30 ℃之間，對水楊酸的降解率均大于60%，降解效果顯著優于其他溫度，最高達78.7%（圖4）;當溫度高于30 ℃時，降解效果逐漸降低。在化感物質含量為500 mg·L?1時，菌株S1的降解率達88.58%，顯著高于其他處理（圖5）。各因素降解率峰值均在設置的培養條件范圍內，說明單因素試驗條件設置合理。

2.4 菌株S1 對人參種子萌發的影響

由圖4和表5可知，對照組種子的胚根長度平均為53.42 mm。0.025和2.500 mg·L?1水楊酸處理對人參種子胚根的抑制作用較弱，而250.000 mg·L?1水楊酸處理的胚根長度顯著低于對照組。RI代表自毒物質對種子的化感作用程度。在水楊酸處理下，胚根長度的RI均為負值，表明水楊酸對人參種子胚根的生長具有一定的抑制作用，且在高水平處理下抑制作用最強。經菌株S1處理后，人參種子的胚根長度平均為60.13 mm，較對照組增加6.71 mm，促生效果達12.56%，且RI為正值（0.154），說明菌株S1不僅緩解了水楊酸對胚根生長的抑制作用，同時對人參種子的胚根發育具有一定促生作用。

對照組種子的胚軸長度平均為27.95 mm。水楊酸處理下人參種子的胚軸長度顯著小于對照，且水楊酸對人參種子胚軸生長的抑制作用隨質量濃度的升高而逐漸增強。菌株S1降解液能在一定程度上緩解水楊酸對人參種子胚軸生長的抑制作用，但其胚軸長度仍顯著小于對照，而胚根長度與對照組無差異顯著，說明胚根對水楊酸的耐受性較胚軸強；胚軸長度的RI為負值，說明在S1降解液處理中還有一定的水楊酸殘留，或是某些代謝產物仍具有自毒性，致使胚軸生長受到抑制。

3 討論

篩選及應用自毒物質降解菌是有效解決連作障礙的措施之一，對抗重茬病害的防治技術和人參產業的健康發展都具有一定的推動作用。本研究在人參連作土壤中發現了10株可降解不同酚酸物質的降解菌，主要以假單胞菌屬為主。研究表明，假單胞菌屬對植物根際自毒物質的降解能力較強，具有促生、固氮和生物防治等功能特性[19]。為了減少試驗因素的影響，明確降解菌對于特定酚酸的降解效率，本研究選取具有高效降解水楊酸能力的菌株S1 進行生防研究，根據形態、生理生化特征、系統發育樹分析，菌株S1鑒定為伯克霍爾德菌屬。研究表明，該菌屬最早在腐爛的洋蔥表面中分離，該屬多種菌株都具有生物修復和植物促生功能[20]。許玉[21]和Han等[22]研究發現，該菌屬的菌株可誘導植物的生長、細胞壁修復酶、植物防御和抗逆、營養物質攝取與積累等代謝途徑。但對于伯克霍爾德菌屬降解自毒物質的研究還鮮有報道。

本研究對菌株S1的培養條件進行了優化，在培養溫度為30 ℃、氮源為硝酸鈣、初始水楊酸含量為500 mg·L?1時降解率達到88.58%，較優化前提高23.26%。田間連作土壤中自毒物質具有積累效應，隨著栽培時間的增長根際土中自毒物質的種類和含量均呈現增多趨勢[23]。因此，提升菌種的降解能力尤為重要。本研究單因素試驗的酚酸含量設置高于土壤，后續還會進一步考察該菌株對酚酸混合物的降解以及與其他微生物的協同作用。

水楊酸即鄰羥基苯甲酸，其芳香環上帶有活性羧基，是抑制種子萌發、降低根系活力的主要原因[24]。本研究表明，菌株S1能緩解水楊酸對人參種子的生長脅迫，對胚根促生效率達12.56%。推測S1降解水楊酸的代謝過程與李敏等[25]研究的微生物降解苯甲酸類酚酸的過程可能一致，既微生物生理代謝過程中首先將苯酚羥基化形成鄰苯二酚，再經過鄰位裂解或間位裂解將苯環開環，降解為低碳化合物或者通過三羧酸循環降解為二氧化碳和水。在自然界中，植物根際分泌的酚酸自毒物質會迅速吸附到礦物質和有機質的表面，降低其有效性，使植物不能充分利用土壤中的營養元素，從而限制植物生長[26]。微生物能降解自毒物質，促進土壤中有機碳礦化，進而為植物及土壤微生物的生長提供養分[27]。因此，利用降解菌株S1作為微生物菌劑進行連作障礙防治，對于解決連作障礙問題具有潛在生防應用價值，為緩解連作障礙的生物有機菌劑研制及完善人參土壤管理技術體系提供了理論依據。

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基金項目：廣西壯族自治區科技重大專項（桂科AA18242026）；廣西壯族自治區科技計劃項目（桂科AB21196019）。