寧德市南美白對蝦副溶血弧菌的分離與藥敏試驗

摘 要：為給寧德市南美白對蝦（Penaeus vannmei）養殖病害提供精準用藥依據，從7個海水養殖場南美白對蝦體內分離病原菌，通過形態學觀察、生理生化和16s rRNA鑒定，確定其分類地位，并進行藥物敏感試驗。結果表明，分離的9株病原菌在TCBS瓊脂培養基中菌落均呈藍-綠色，通過革蘭氏染色鏡檢可見為革蘭氏陰性菌，呈棒狀、弧狀、卵圓狀，無芽孢。在氧化酶反應、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、甘露醇、6%鹽胨水、8%鹽胨水、動力等8項試驗中，結果呈陽性，確定為副溶血弧菌。9株副溶血弧菌對青霉素、新霉素、四環素等3種藥物耐受比例較高，對恩諾沙星、呋喃唑酮、萬古霉素等6種藥物均高度敏感。

關鍵詞：南美白對蝦（Penaeus vannmei）；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；分離鑒定；藥敏試驗

南美白對蝦（Penaeus vannmei）又名凡納濱對蝦，因其生長速度快、鹽度適應強、經濟效益好等特點，生產區域在我國廣泛分布，也是對蝦養殖產量最高的品種之一[1-2]。根據寧德市漁業統計年鑒，2022年全市南美白對蝦海水養殖產量2.16萬t，淡水養殖產量0.21萬t，全市南美白對蝦養殖以海水養殖為主[3]。伴隨著南美白對蝦產業發展，病害問題成為制約南美白對蝦養殖業發展的瓶頸，當前南美白對蝦養殖過程中病害種類多、發展快，主要的病害有病毒性疾病（白斑綜合征、肝胰腺壞死病等）和細菌性疾病（紅腿病、腸炎病、白便綜合征等）[4-7]，其中又以細菌性疾病最為常見。

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，也是南美白對蝦養殖中細菌性疾病最主要的致病菌，會造成對蝦急性肝胰腺壞死病（AHPND），是近年來導致全球對蝦養殖大規模減產的重要病害之一[8]，同時該菌也是水產品中典型的食源性致病菌，誤食易引起人體急性腸胃炎[9]。如何在南美白對蝦養殖過程中科學“處理”副溶血弧菌，對養殖效益至關重要，當前應對水產養殖病害還是以使用抗生素藥品為主，若長期、大量使用抗生素會使病原菌產生抗藥性，對水產品質量安全和人類健康造成潛在危害[10]。

筆者從福建省寧德市蕉城區、福鼎市和霞浦縣等沿海地區7個海水養殖場在養南美白對蝦分離出病原菌，并進行生理生化特征和藥敏特性分析鑒定，旨在為寧德地區南美白對蝦養殖病害防治提供精準用藥依據，科學指導養殖戶健康養殖。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣品分別于2022年3月、5月從蕉城區、福鼎市和霞浦縣南美白對蝦海水養殖場隨機采集健康生長無病害的南美白對蝦，共計9份。其中，蕉城區3份樣品于2022年3月采自蕉城區A養殖場的不同養殖池；福鼎市3份樣品于2022年5月分別采自福鼎市B、C、D養殖場；霞浦縣3份樣品于2022年5月分別采自霞浦縣E、F、G養殖場。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 將南美白對蝦肝、胰腺組織用一次性無菌接菌環在TCBS瓊脂培養基上劃線，放置在28 ℃恒溫培養箱中過夜培養，再將單個菌落在液體BHI培養基中擴增培養。

1.2.2 病原菌生理生化鑒定 對純化菌株進行革蘭氏染色，將單個菌落按照生化鑒定試劑說明書操作，培養觀察反應現象。

1.2.3 病原菌分子鑒定 通過通用16S rRNA引物27F/1492R進行基因擴增。引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。反應體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL、ddH2O 10 μL；反應程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 10 min。進行PCR擴增，將擴增的PCR產物送生工生物工程 （上海） 股份有限公司進行測序，測序結果通過美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）網站比對。

1.2.4 病原菌藥敏特性測定

結合水產養殖實際生產過程中可能使用的9大類18種抗生素的藥敏特性進行測定，其中包括氯霉素類抗生素：氯霉素（chloroamphenicol）；硝基呋喃類抗生素2種：呋喃唑酮（furazolidone）、呋喃妥因（furadantin）；β內酰胺類抗生素2種：新生霉素（novobiocin）、青霉素（penicillin）；氨基糖苷類抗生素5種：新霉素（neomycin）、鏈霉素（streptomycin）、萬古霉素（vancomycin）、卡那霉素（kanamycin）、慶大霉素（gentamicin）；喹諾酮類抗生素3種：氧氟沙星（ofloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、恩諾沙星（enrofloxacin）；四環素類抗生素2種：四環素（tetracycline）、多西環素（doxycycline）；大環內酯類：紅霉素（erythromycin）；磺胺類抗生素：復方新諾明（trimethoprim/sulfamethoxazole）；利福霉素類抗生素：利福平（rifampin）。

將純化好的菌株接種到TSA瓊脂培養基上，于28 ℃培養24 h，然后用滅菌生理鹽水無菌操作洗下菌落，并用麥氏比濁調到0.5；用移液器取100 μL菌液于培養基上，均勻涂布在MH培養基表面，每次涂布完1/3平板時即將平板旋轉60°直至涂滿整個平板，連續涂布3次，以保證涂布均勻；再分別依次貼上18種藥敏紙片，每塊平板貼4片，28 ℃溫箱中正置培養30 min后再倒置過夜培養，判定結果，每次試驗均重復三次。本研究所用藥敏紙片為杭州濱和微生物試劑有限公司生產，藥敏特性參照該公司的《紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑判斷標準》和美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）所給出副溶血弧菌相關抗生素敏感性標準作為判定依據。

2 結果

2.1 病原菌分離結果

蕉城區A養殖場不同養殖池樣品分離出3株菌株，分別命名為JX1、JX2、JX3；福鼎市B、C、D養殖場樣品分離出3株菌株，分別命名為FD1、FD2、FD3；霞浦縣E、F、G養殖場樣品各分離出1株菌株，分別命名為XP1、XP2、XP3。

2.2 病原菌生理生化鑒定結果

9株病原菌在TCBS瓊脂培養基中菌落均呈藍-綠色，通過革蘭氏染色鏡檢可見為革蘭氏陰性菌，呈棒狀、弧狀、卵圓狀，無芽孢。由生理生化鑒定結果可知（表1），9株病原菌特征與《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》（GB 4789.7-2013）中副溶血弧菌主要特征完全符合。

2.3 病原菌分子鑒定結果

將獲得的序列在Gen Bank數據中進行同源序列比對，結果發現序列相似性高的大部分為副溶血弧菌，與致病性副溶血弧菌有99%的同源性，經生理生化鑒定與副溶血弧菌指標一致。最終根據生理生化鑒定和16S rRNA基因測序結果，確定分離的9株菌均為副溶血弧菌。

2.4 病原菌的藥敏特性

由藥敏試驗結果（表2）可知，9株副溶血弧菌中，除編號為XP1的副溶血弧菌對18種藥物均高度敏感外，其余菌株對18種藥物均有不同程度的耐藥，其中FD1耐藥譜最廣，對7種藥物耐藥，其次分別為JX2（6種）、FD3（5種）、JX1（3種）、JX3（3種）、FD2（3種）、XP2（2種）、XP3（2種）、XP1（1種）。同時，不同區域分離菌株的藥敏特性也存在差異，蕉城區的3株菌株均對氯霉素、呋喃唑酮、呋喃妥因、新生霉素、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星高度敏感，對新霉素、四環素耐藥；福鼎市的3株菌株均對呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星高度敏感，對青霉素耐藥；霞浦縣的3株菌株除對新霉素、慶大霉素藥敏特性存在差異，對青霉素耐藥外，對其余15種藥物均高度敏感。對比耐藥情況可知，9株副溶血弧菌對青霉素耐藥率最高（88.9%），其次分別為新霉素（77.8%）、四環素（55.6%），9株副溶血弧菌均對呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星等6種抗生素高度敏感。

3 討論與分析

3.1 副溶血弧菌對寧德市水產養殖業的影響

本研究中，寧德市7家南美白對蝦海水養殖場均有檢出副溶血弧菌，雖然在采樣期間上述養殖場未發生相關病害，但若不及時采取預防措施，隨著養殖殘餌、糞便及其他有機物在池底沉積和有害細菌大量繁殖，最終可能會引起水質惡化，導致養殖病害的發生。此外，副溶血弧菌也會對其他養殖品種帶來不利影響，以寧德市大黃魚養殖為例，副溶血弧菌是造成養殖大黃魚爛身、斷尾、腹水等一系列弧菌病的主要因子[11-13]。如果南美白對蝦養殖過程中亂用、濫用抗生素，則容易導致病原菌耐藥性增加，伴隨著養殖過程水體交換，相鄰養殖區域的大黃魚必然受到影響。因此，養殖過程必須提倡精準用藥，對病害的防治也不能局限在單一養殖品種，要謹防多重耐藥問題，加強致病菌耐藥性和耐藥基因監測。

3.2 不同地區南美白對蝦副溶血弧菌耐藥性對比

當前，國內關于南美白對蝦副溶血弧菌藥敏特性的研究并不鮮見，其中廣西南美白對蝦源副溶血弧菌對磺胺二甲嘧（97.00%）、青霉素G（89.55%）、氨芐青霉素（79.11%）的耐藥率較高[14]；上海南美白對蝦源副溶血弧菌對青霉素G（95.24%）、磺胺甲噁唑（71.43%）、氨芐西林（61.91%）的耐藥率較高[15]；山東南美白對蝦源副溶血弧菌對慶大霉素（98%）、硫酸新霉素（90%）、氨芐西林（86%）耐藥率較高[16]。對比可知，各地南美白對蝦源副溶血弧菌抗生素耐藥性均存在差異。本研究中，蕉城區、福鼎市和霞浦縣南美白對蝦養殖場分離出的副溶血弧菌對青霉素（88.9%）、新霉素（77.8%）和四環素（55.6%）耐藥性較高，耐藥性結果與廣西、上海、山東等地的研究結果相近，均對青霉素和新霉素耐藥。考慮到產生耐藥性的原因復雜多樣，可能受副溶血弧菌基因序列、人為用藥習慣不同等影響，但具體如何影響仍需進一步研究。

3.3 寧德市南美白對蝦健康養殖建議

本研究中，寧德地區9株副溶血弧菌均對呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星等6種抗生素高度敏感。根據《獸藥管理條例》《水產養殖用藥明白紙2022年1、2號》等有關規定，呋喃唑酮、呋喃妥因、萬古霉素為禁用藥，氧氟沙星、諾氟沙星為停用藥，恩諾沙星為限用藥，結合水產養殖過程中不得使用禁、停用藥，因此，在實際養殖生產過程中若發生相關病害可嘗試使用恩諾沙星進行預防治療，但要嚴格遵守休藥期制度。

結合筆者走訪寧德市南美白對蝦養殖場相關情況，發現大部分養殖戶管理房中存放的投入品種類較多，主要為各種微生態制劑，養殖現場較少發現抗生素。當前國內許多專家學者認為應對南美白對蝦病害應堅持“預防為主，綜合防治”原則，通過提高養殖管理水平，注意養殖過程水質調控和投餌管理，營造良好的養殖環境[4，17]，降低養殖病害發生率。因此，在養殖過程添加適當微生態制劑也可以起到改善養殖環境、抑制病原微生物、提高機體免疫力等作用[18]。

參考文獻：

[1]國家蝦蟹產業技術體系.南美白對蝦產業發展報告[J].中國水產，2021（5）：27-36.

[2] 吳琴瑟.南美白對蝦養殖現狀與發展對策[J].科學養魚，2006（10）：1-2.

[3] 寧德市海洋與漁業局.寧德漁業年鑒2022[Z].寧德，2022.

[4] 沈文英，陽會軍，尹軍霞.南美白對蝦的病害及防治研究現狀[J].水利漁業，2004（1）：58-60.

[5] 朱澤聞，陳愛平，李文旭，等.南美白對蝦兩大病毒病流行分析及趨勢預測[J].科學養魚，2007（4）：49-50.

[6] 于秀娟，李清，陰鴻達.全國水產養殖病害預測預報[J].中國水產，2021（7）：99-105.

[7] 曹海鵬，溫樂夫，周桂嫻，等.南美白對蝦白便綜合征病原霍亂弧菌的分離與藥敏試驗[J].動物醫學進展，2016，37（2）：128-132.

[8] 賈丹，史成銀，黃倢，等.凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病（AHPND）病原分離鑒定及其致病性分析[J].漁業科學進展，2018，39（3）：103-111.

[9] 韓小龍，張海燕，曹明秀，等.我國海產品中副溶血性弧菌的污染現狀與控制策略分析[J].食品與發酵工業，2015，41（7）：263-267.

[10] 陳田聰，謝達祥，陳曉漢.南美白對蝦淡水養殖常見病害及防治措施[J].南方農業，2018，12（20）：145-147.

[11] 鄢慶枇，王軍，蘇永全，等.網箱養殖大黃魚弧菌病研究[J].集美大學學報（自然科學版），2001（3）：191-196.

[12] 許斌福，林能鋒，楊金先，等.大黃魚副溶血弧菌的分離、鑒定及致病力分析[J].福建農業學報，2002（3）：174-177.

[13] 紀榮興，鄒文政，李印龍.大黃魚皮膚潰爛病病原的研究[J].海洋科學， 2004（11）：57-60.

[14] 劉杰，曾令澤，賀曉晨，等.廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌的分離鑒定及其耐藥性[J].廣西畜牧獸醫，2019，35（5）：197-202.

[15] 高曉華，安偉，張明輝.上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性及其耐藥基因檢測分析[J].南方農業學報，2021，52（3）：827-836.

[16] 李翠蘋，翟倩倩，王想，等.對蝦養殖池副溶血弧菌的分離鑒定及其耐藥特征、毒力基因分析[J].漁業科學進展，2020，41（6）：174-180.

[17] 張美玲.淺談南美白對蝦病害原因及防控策略[J].水產養殖，2018，39（12）：44-46.

[18] 陳曉明，郭增祥.微生態制劑防控南美白對蝦病害試驗[J].河北漁業，2015（11）：30-31.