香蕉枯萎鐮刀菌4號生理小種FoSP1基因功能的初步分析

摘""要：香蕉枯萎病是我國香蕉生產中危害最大，且難以防治的一種真菌病害。由于香蕉枯萎病的影響，我國近年來香蕉種植面積逐年減少，給我國亞熱帶、熱帶香蕉產業帶來了巨大的經濟損失。該病害是由于香蕉的維管束受到病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium"oxysporum"f."sp."cubense，"Foc）入侵而發生，其繁殖速度快，引起香蕉葉片黃化和植株萎蔫。通過比較Foc1號生理小種（Foc1）N2菌株和4號生理小種（Foc4）B2菌株的基因組及轉錄組序列，篩選出位于基因組特異區間并且表達量較高的分泌蛋白FoSP1。結果表明：FoSP1基因開放閱讀框為387"bp，編碼129個氨基酸，其信號肽切割位點位于第20～21位氨基酸殘基之間，且該蛋白無任何已知的結構域和功能位點，因此推斷出FoSP1是一個新的分泌蛋白。為了研究該蛋白在Foc4菌株中的生物學作用，本研究利用split-marker的方法敲除了B2菌株的FoSP1基因，并對獲得的正確敲除突變體進行表型分析和致病性測定。結果表明：相比野生型B2菌株，FoSP1基因敲除突變體菌絲的營養生長無顯著差異，對NaCl、山梨醇和H2O2等外源脅迫均表現不敏感，但敲除突變體的產孢量和分生孢子萌發率顯著降低，且對巴西蕉苗的致病力明顯減弱。由此推測分泌蛋白FoSP1不參與Foc4菌株B2的營養生長，但在其產孢及致病的過程中發揮著重要作用。此結果為進一步研究Foc4基因組特異區間分泌蛋白的致病機制奠定基礎。

關鍵詞：尖孢鐮刀菌古巴?；?；FoSP1；分泌蛋白；基因敲除；致病性

中圖分類號：Q945.8""""""文獻標志碼：A

Preliminary"Analysis"of"FoSP1"Gene"Function"of"Fusarium"oxysporum"f."sp."Cubense"Race4

ZHAO"Jiujuan1，2，"LI"Min1，"HU"Meijiao1，"YANG"Jinyu1，3，"HE"Ying1，4，"LIU"Zhiqiang2，"SUN"Jinhua1*

1."Environment"and"Plant"Protection"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."School"of"Life"and"Health"Sciences，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"3."School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou，"Hainan"570228，"China;"4."Center"for"Research"and"Development"of"Fine"Chemicals，"Guizhou"University，"Guiyang，"Guizhou"550025，"China

Abstract："Banana"Fusarium"wilt"is"a"fungal"disease"which"is"the"most"harmful"and"difficult"to"control"in"banana"production"in"China."Due"to"the"influence"of"banana"Fusarium"wilt，"the"banana"planting"area"in"China"has"been"decreasing"year"by"year"in"recent"years，"which"has"brought"huge"economic"losses"to"the"subtropical"and"tropical"banana"industries"in"China."The"disease"occurred"because"the"vascular"bundle"of"banana"was"invaded"by"Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense"（Foc），"and"its"propagation"speed"was"fast，"which"caused"the"yellowing"of"banana"leaves"and"plant"wilting."By"comparing"the"genome"and"transcriptome"sequences"of"Foc"race"1"（Foc1，"N2）"and"race"4"（Foc4，"B2），"a"secreted"protein"FoSP1"located"in"the"lineage-specific"region"with"high"expression"was"screened"out."The"results"showed"that"the"open"reading"frame"of"FoSP1"gene"was"387"bp，"encoding"129"amino"acids，"and"its"signal"peptide"cleavage"site"was"located"between"the"20th"and"21st"amino"acid"residues，"and"the"protein"had"no"known"domain"and"functional"site，"so"it"was"inferred"that"FoSP1"was"a"new"secreted"protein."In"order"to"study"the"biological"function"of"the"protein"in"Foc4"strain，"the"split-marker"method"was"used"to"knock"out"the"FoSP1"gene"of"B2"strain，"and"the"phenotype"analysis"and"pathogenicity"determination"of"the"correctly"knocked-out"mutant"were"carried"out."The"results"showed"that"compared"with"wild-type"B2"strain，"there"was"no"significant"difference"in"the"vegetative"growth"of"FoSP1"gene"knockout"mutants，"and"they"were"insensitive"to"exogenous"stresses"such"as"NaCl，"D-sorbitol"and"H2O2，"but"the"conidial"yield"and"germination"rate"of"knockout"mutants"were"significantly"reduced，"and"their"pathogenicity"to"Brazilian"banana"was"significantly"weakened."It"is"inferred"that"the"secreted"protein"FoSP1"does"not"participate"in"the"vegetative"growth"of"B2"strain"，"but"plays"an"important"role"in"the"process"of"sporulation"and"pathogenicity."This"result"lays"a"foundation"for"further"study"on"the"pathogenic"mechanism"of"secreted"proteins"in"the"genome"lineage-specific"region"of"Foc4.

Keywords："Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense;"FoSP1;"secreted"protein;"gene"knockout;"pathogenicity

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.004

作為香蕉的主產國之一，我國有著悠久的香蕉種植史。目前，香蕉是我國熱帶地區重要的經濟支柱產業之一[1]。香蕉枯萎病是我國香蕉生產中危害最大，且難以防治的一種真菌病害，由于香蕉枯萎病的影響，我國近年來香蕉種植面積逐年減少，給我國亞熱帶、熱帶香蕉產業帶來了巨大的經濟損失。該病害是由于香蕉的維管束受到病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium"oxysporum"f."sp."cubense，"Foc）入侵而發生。作為一種土傳病害，該病原菌可從根系侵入，定殖維管束從而引起香蕉葉片黃化和植株萎蔫。其繁殖速度快，能隨帶病蕉苗傳播擴散，致病力極強，并且能夠在土壤中存活幾十年[2]。尖孢鐮刀菌古巴?；陀?個生理小種，其中，4號生理小種（Foc4）能夠侵染幾乎所有品種的香蕉，對香蕉的危害性與毀滅性最大[3-4]。

分泌蛋白是一類在生物體內合成和加工成熟的多肽，經過細胞膜分泌到胞外，參與對周圍環境的感知和生物間的相互作用[5]。分泌蛋白一般具有4個基本特征，最主要特征是它的氨基酸序列具有Ｎ端信號肽序列，其次是分泌蛋白不存在跨膜結構域，不具有將蛋白輸送到線粒體以及其他胞內細胞器的預測定位信號序列，并且沒有糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，"GPI）錨定位點[6]。植物病原真菌的一些分泌蛋白在其致病過程中起著重要的作用。郭立佳等[7]發現假定分泌蛋白SP10參與Foc4對香蕉致病性的調控；DOEHLEMANN等[8]研究發現，敲除玉米黑穗病菌分泌蛋白基因pep1的敲除突變體菌株無法正常侵入宿主細胞；SAITOH等[9]研究結果發現，稻瘟病菌侵染水稻時，分泌蛋白MC69對病原菌侵染菌絲的形成是必需的。

在前期的研究中，本研究團隊基于三代Pacbio"CCS測序技術組裝完成了Foc1（菌株編號：N2）和Foc4（菌株編號：B2）T2T完整基因組（結果待發表）。通過比較二者染色體DNA序列，在Foc4菌株的1號染色體的末端鑒定到Foc4菌株特有而Foc1菌株缺失的約1"Mb大小的基因組特異區間（Lineage-specific"genomic"region，"LSGR）。進一步分析發現，該基因組特異區間相對于染色體其它區域，預測的分泌蛋白（N端帶信號肽且無跨膜結構域）顯著富集。結合轉錄組測序，從中選擇1個具有一定表達值且富含半胱氨酸（含量為8.5%）的分泌蛋白Foc4_01G021900.1作為研究對象，命名為FoSP1。本研究采用split-marker方法對FoSP1基因進行敲除，通過比較突變體與野生型的表型和致病力差異，明確分泌蛋白FoSP1在B2菌株中的生物學功能，以期為研究基因組特異區間分泌蛋白的致病機制提供新的方向和思路。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試香蕉品種""巴西蕉（Musa"sp."AAA）試管苗由中國熱帶農業科學院組織培養中心提供。試管苗經沙床煉苗1個月，后移栽到椰糠和砂土1∶1的基質上。待蕉苗達5～6葉齡，且株高20～30"cm時進行接種試驗。

1.1.2""菌株、質粒""Foc4"B2菌株及質粒pCT74［含潮霉素磷酸轉移酶基因（hyg）］均由本實驗室保存。

1.1.3""引物設計""從測序結果中查找并提取FoSP1基因及其上、下游1500"bp的堿基序列，根據目的基因上、下游基因序列以及hyg的堿基序列，設計構建基因敲除融合片段所需的PCR引物和目的基因內、外部驗證引物，該引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.1.4""試劑、酶及培養基""潮霉素B（Hygromycin"B，50"mg/mL）、氨芐青霉素（Amp）、溶壁酶、蝸牛酶、高保真酶、MightyScript第一鏈cDNA合成Master"Mix及50×TAE電泳緩沖液及DNA"marker均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）、2×Taq"PCR"Master"Mix及真菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）均購于天根（北京）生化科技有限公司；普通質粒小提試劑盒（離心柱型）購于Omega"Bio-Tek公司；山梨醇（D-Sorbitol）購于北京索萊寶生物技術有限公司；2×A8"FastHiFi"PCR"MasterMix購于北京艾德萊生物科技有限公司；膠回收試劑盒（TaKaRa"MiniBEST"Aga rose"Gel"DNA"Extraction"Kit"Ver.4.0）購于寶日醫生物技術（北京）有限公司；其他具體試劑詳見試驗步驟。試驗所用培養基包括PDA培養基、TB3液體培養基、TB3固體培養基、LB液體培養基、LB固體培養基、CM培養基、MM培養基和CZAPEK培養基等。

1.2""方法

1.2.1""pCT74質粒DNA的提取""將質粒pCT74轉移至DH5α中，培養后接入LB固體培養基，挑取單菌落接種于3"mL含有Amp抗性的LB液體培養基中，37"℃、250"r/min振蕩培養12"h左右。隨后將菌液轉移至1.5"mL離心管，12"000"r/min離心1"min，保留沉淀。參照普通質粒小提試劑盒的方法提取質粒DNA，并對其進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2""B2菌株基因組DNA的提取""將野生型菌株B2接種到裝有100"mL"PDB培養基的錐形瓶中，180"r/min、28"℃搖床振蕩培養3"d，3層擦鏡紙過濾收集菌絲，按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.2.3""目的基因的克隆""根據B2菌株基因組注釋的信息獲取目的基因的全長序列信息。采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取B2菌株總RNA，然后利用MightyScript第一鏈cDNA合成Master"Mix合成cDNA。根據基因序列設計引物（表1），以B2菌株cDNA為模板，對目的基因進行PCR擴增，獲得的PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測出條帶單一且大小正確的條帶后測序，將得到的測序結果與目的基因的原始序列分別在NCBI網站上進行BLAST比對，確定序列的正確性。

1.2.4""FoSP1基因敲除融合片段的構建""以提取的B2基因組DNA為模板，FoSP1-AF/FoSP1-AR和FoSP1-BF/FoSP1-BR為引物分別對FoSP1基因上、下游序列進行PCR擴增；以提取的pCT74質粒DNA為模板，HygF-pCT74/HygR-pCT74為引物對hyg基因序列進行PCR擴增。split-marker重疊PCR擴增時分別以FoSP1基因上游PCR擴增產物（A臂）和hyg基因PCR擴增產物為模板，FoSP1-AF/YGR為引物；以FoSP1基因下游PCR擴增產物（B臂）和hyg基因PCR擴增產物為模板，HYF/FoSP1-BR為引物進行PCR擴增。所有PCR過程選擇適宜的退火溫度及延伸時間，優化PCR程序條件，對得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5""原生質體的制備與轉化""B2菌株在PDA固體培養基上培養3"d后，挑取菌絲在PDB液體培養基中搖培2"d，收集孢子懸浮液轉移至新的PDB液體培養基中培養18"h，過濾，收集菌絲并用0.7"mol/L"NaCl沖洗2遍。挑取菌絲加入酶解液（含10"mg/mL溶壁酶和20"mg/mL蝸牛酶），90"r/min搖床裂解3"h。用1×STC調整原生質體濃度為5×107～5×108個/mL。將原生質體（200"μL）和上、下游PCR重疊片段（各10"μL）混勻，冰上靜置30"min，逐滴加入1"mL"40%"PTC，輕搖混勻，室溫下靜置20"min。原生質體用加有5"μL"Amp的5"mL"TB3液體培養基進行轉化，28"℃、50"r/min振蕩培養12"h。將菌液和含hyg抗性的TB3下層固體培養基混勻，倒平板，28"℃培養12"h，倒入含hyg的TB3上層培養基，28"℃培養2～5"d。

1.2.6""FoSP1敲除突變體的篩選與驗證""挑取轉化子于含hyg的PDA平板，28"℃培養5"d，刮取菌絲提取基因組。以提取的轉化子基因組DNA及野生型B2基因組DNA為模板，FoSP1-outsideF/"FoSP1-outsideR作引物進行PCR正篩，FoSP1-"insideF/FoSP1-insideR作引物進行PCR負篩，并對得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，只有正、負篩選擴增出的條帶均符合預期結果的轉化子才能被確定為正確的敲除突變體。

1.2.7""敲除突變體營養生長表型分析""取野生型菌株和敲除突變體直徑為5"mm的菌餅，分別接種到PDA、CM、MM及CZAPEK培養基上，28"℃培養5"d，測量菌落直徑，每個處理設3個重復。

1.2.8""分生孢子產生及萌發""取野生菌株和敲除突變體直徑為5"mm的菌餅，分別加入3"mL無菌水中，震蕩懸浮混勻，計算每毫升的孢子數并統計及比較孢子萌發率，每個處理3個重復。

1.2.9""脅迫因子敏感性試驗""滲透壓脅迫試驗：打取直徑為5"mm的野生型和敲除突變體的菌餅分別接種于不同濃度NaCl（1、2"mol/L）和山梨醇（1、2"mol/L）的PDA平板上，每個梯度做3個重復，28"℃培養5"d后觀察菌落形態，并拍照記錄。過氧化氫耐受性試驗：打取直徑為5"mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，分別接種于含有不同濃度H2O2（0.1%、0.25%、0.5%）的PDA平板上，每個梯度3個重復，28"℃培養5"d后觀察菌落直徑大小，并拍照記錄。

1.2.10""致病性測定""將FoSP1基因野生型菌株和敲除突變體菌株分別接種于100"mL的PDB液體培養基中，180"r/min、28"℃搖床振蕩培養3"d，過濾收集分生孢子并用無菌水重懸，將孢子懸浮液調至106個/mL。野生型菌株與敲除突變體菌株孢子懸浮液分別接種10株巴西蕉幼苗，刺傷根部后每株苗澆50"mL孢子懸浮液，以清水作為對照。30"d后觀察外部葉片黃化情況，切開球莖，觀察球莖褐變程度，拍照記錄并記錄幼苗發病級數，病害分級及病情指數計算參照郭立佳等[10]的方法。數據采用Excel和SPSS軟件進行統計分析。

2""結果與分析

2.1""FoSP1基因預測編碼產物生物信息學分析

本試驗克隆出FoSP1基因的全長，其開放閱讀框長為387"bp，其蛋白編碼129個氨基酸，等電點（pI）為8.29，其中半胱氨酸含量為8.5%。原子總數為1869，蛋白分子式為C593H911N169"O182S14，其不穩定指數為51.04，總平均親水性系數為-0.321，表明該蛋白為親水蛋白，不具有穩定性。使用TargetP和SingalP軟件預測該蛋白為分泌蛋白，其信號肽切割位點位于第20～21位氨基酸殘基之間；TMHMM軟件預測結果顯示，FoSP1蛋白沒有跨膜結構域；用big-Pi"Predictor軟件預測結果顯示，該蛋白沒有GPI位點；用PROSITE軟件分析結果顯示，該蛋白無任何已知的結構域和功能位點。因此，FoSP1是一個新的分泌蛋白。

2.2""構建基因敲除線性片段

采用split-marker方法對FoSP1基因進行敲除（圖1）。PCR擴增得到1390"bp的潮霉素基因片段以及1297"bp的A臂和1367"bp的B臂；第2輪PCR擴增融合片段A-hyg和hyg-B，分別擴增出2338、2138"bp的DNA條帶，經測序，結果與目的條帶序列一致，A-hyg和hyg-B敲除線性片段構建成功。

2.3""敲除突變體的PCR鑒定

將FoSP1基因敲除線性片段轉化至野生型菌株B2原生質體，后經再生培養及復篩，獲得若干轉化子，任取其中10個轉化子進行PCR鑒定。正篩結果顯示，10個轉化子均能擴增出1條約1590"bp的目的條帶，而野生型菌株基因組DNA擴增出735"bp的目的條帶（圖2A）；負篩結果顯示10個轉化子基因組均未擴出條帶，野生型菌株B2基因組擴增出1條約416"bp的條帶（圖2B）。將轉化子PCR產物送出測序，測序結果與目的片段序列一致。以上結果表明，所挑選的10個轉化子均為FoSP1基因敲除突變體，選取1株用于后續試驗，命名為ΔFoSP1。

2.4nbsp;"基因敲除突變體營養生長表型分析

在4種不同的營養培養基上，突變株ΔFoSP1的菌落形態特征與野生型菌株的菌落形態特征相似（圖3A），并且突變株的菌落直徑大小與野生型無顯著差異（圖3B），說明FoSP1蛋白不影響B2菌株的菌落形態和營養生長。

2.5""基因敲除突變體分生孢子的產生及萌發

計算平板菌落生長邊緣菌塊的孢子產量，結果表明，突變株的分生孢子產量極顯著低于野生型菌株（Plt;0.01），野生型菌株的孢子產量約為9.2×105個/mL，ΔFoSP1的孢子產量約為3.6×105個/mL（圖4A）。在分生孢子萌發過程中，突變株的分生孢子萌發率極顯著低于野生型（Plt;0.01）。8"h時野生型菌株的分生孢子萌發率達到70%左右，突變株的萌發率在40%～50%之間（圖4B）。綜合研究表明，與野生型相比，FoSP1基因敲除突變體產孢量減少、分生孢子萌發率降低，由此可見，FoSP1基因對B2菌株的產孢過程有影響。

2.6""脅迫因子敏感性分析

分別選擇在加有不同濃度的NaCl和山梨醇的PDA平板上進行滲透壓脅迫試驗，28"℃恒溫培養5"d后，敲除突變體和野生型菌株菌落生長情況在加有NaCl和山梨醇的PDA平板上無明顯差異。氧化脅迫分別選擇在加入不同濃度H2O2的PDA平板上進行試驗，28"℃恒溫培養4"d后發現，隨著H2O2濃度的增大，敲除突變體和野生型受到的抑制均呈現不同程度的增強，敲除突變體和野生型菌株生長無明顯差異（圖5）。說明FoSP1蛋白不參與B2菌株對于外源脅迫壓力的適應性。

2.7""基因敲除突變體對巴西蕉的致病性

在巴西蕉幼苗上對ΔFoSP1突變株進行致病性測定。接種培養30"d后觀察發現：對照組蕉苗無發病癥狀，其余蕉苗均呈現不同程度的發病情況；試驗組中，接種野生型菌株的蕉苗，大部分葉片出現大面積的黃化現象，部分植株下部葉片已經枯死，縱切球莖后可以觀察到其維管束褐化較為嚴重，發病部位呈黑褐色；接種ΔFoSP1菌株的蕉苗發病程度較輕，植株部分葉片邊緣出現黃化，切開球莖后發現其褐化面積較少或者未出現褐化現象（圖6A）。病情指數統計結果表明，接種敲除突變體菌株ΔFoSP1的巴西蕉幼苗平均病情指數（30.7）顯著低于野生型菌株B2（51.7）（圖6B，Plt;0.05）。由此可見，敲除FoSP1基因導致B2菌株對巴西蕉的致病性減弱。

3""討論

近年來，植物真菌全基因組序列的解析為植物病原的分泌蛋白組提供了重要的研究基礎。于欽亮等[11]基于生物信息學的方法對禾谷鐮刀菌（F."graminearum）全基因組進行信號肽分析，預測出

606個潛在的分泌蛋白編碼基因，其中有79個分泌蛋白具有可預測的功能性描述。MA等[12]以鐮刀菌屬中3個不同寄主范圍的生理小種，包括禾谷鐮刀菌、輪枝鐮刀菌（F."verticillioides）和尖孢鐮刀菌番茄專化型（F."oxysporum"f."sp."Lycopersici）為研究對象，對其分泌蛋白組進行差異比較，發現了強毒菌株特有的4條譜系特異性（LS）基因組區域的LS染色體可將弱毒株轉化為強毒株，LS染色體中含有大量的激發子類和細胞壁降解酶類分泌蛋白基因，從而證明分泌蛋白類群在鐮刀菌生物學毒性中起重要作用。黃影華[13]通過基因組和轉錄組測序的方法對菌株Foc"TR4-14013進行全基因組表達量測定，并通過對所選的5個分泌蛋白進行基因克隆、基因敲除和致病性分析，首次對其功能進行了研究。病原真菌分泌蛋白的研究進展，一方面增進了對病原真菌分泌蛋白的分泌機制的了解，另一方面進一步闡明了病原真菌對植物的致病過程[11]。真菌的分泌蛋白分子量一般較小，半胱氨酸含量較高。在尖孢鐮刀菌SIX家族蛋白質中，所有SIX6分泌蛋白均具有8個保守的半胱氨酸殘基，其中1個位于信號肽中[14]；Foc菌株中flh2基因編碼蛋白的半胱氨酸含量占總氨基酸序列的3%[6]。本研究的FoSP1蛋白與該研究相比，半胱氨酸含量更高，為8.5%，因此具有分泌蛋白的特性。本研究中，FoSP1基因敲除突變菌株ΔFoSP1的營養生長、菌落形態特征均未產生明顯變化，這表明其不參與Foc4"B2菌株營養生長過程的調控。分生孢子是大多數真菌的無性繁殖方式，對真菌形成侵染循環至關重要[15]。鐮刀菌在孢子萌發后形成菌絲體，可侵染作物根尖或新鮮傷口組織，在寄主體內繁殖并產生大量的致病性相關分泌物[16]。魏晨星[17]研究發現Foc4菌株FoCaMK基因敲除突變體生長速率及菌落形態與野生型菌株相比無顯著差異，但產孢量明顯降低，致病性顯著降低；聶燕芳等[18]的研究表明，Foc4菌株敲除突變體ΔFoupe1的菌絲和孢子形態無明顯差異，并且對NaCl、山梨醇脅迫不敏感，但菌株菌落生長和產孢量顯著下降，并且對巴西蕉的致病力顯著降低；GUO等[19]發現Fosp9基因敲除突變體可能對真菌生長和發育無影響，且對滲透脅迫的耐受性、細胞壁降解酶的分泌無影響，本研究結果與其相似。

綜上所述，FoSP1蛋白是一個新的分泌蛋白，使用split-marker基因敲除獲得了FoSP1敲除突變菌株，通過分析FoSP1基因敲除菌株表型和致病性的變化，初步揭示FoSP1蛋白參與尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種B2的產孢、孢子萌發及其對香蕉致病性的調控。此結果為進一步研究基因組特異區間分泌蛋白在尖孢鐮刀菌致病過程的作用奠定了良好基礎。

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