玉米單倍體育種技術發展現狀及高效應用展望

摘要：玉米是我國重要的糧食作物之一，也是常用的飼料作物，選育優良玉米品種對保障糧食安全和促進農業發展有非常重要的作用。通過使用單倍體育種技術，可以將純系的育種時間從6～7代縮短為1～2代，從而加快育種進程，提升優良品種的選育效率。對玉米單倍體育種技術研究進展和高效評價方法進行綜述，包括誘導系的選擇和加倍方法的篩選。目前，DH系生產的工程化水平顯著提高。在單倍體評價過程中，通過田間觀察篩選、分子檢測篩選、全基因組選擇技術開展了DH系的高效評價研究。玉米單倍體育種技術與全基因組選育技術的有機結合，有助于高效篩選出符合育種要求的DH系，進一步提升單倍體工程化應用效率，在育種過程中具有良好的應用前景。

關鍵詞：單倍體；DH系；玉米；篩選；全基因組選擇

Development Status and Efficient Application Prospect of

Maize Haploid Breeding Technology

XU Liyuan，WANG Liming，REN Zhengpeng，SHE Ning?an，WANG Limei，

LIU Fang，MA Xiaochuan，LI Hailiang，CUI Mingliang

（Hefei Fengle Seed Industry Co.，Ltd.，Hefei 230088）

玉米育種過程中一個關鍵的步驟是穩定純系的獲得，單倍體育種技術通過誘導產生單倍體植株并進行染色體加倍，迅速獲得純合的自交系，這一過程相較于傳統方法大大縮短了育種周期，僅需一代即可達到純合狀態，從而快速鎖定目標性狀。經過世界各地的學者和專家在高效誘導系創制、單倍體的穩定加倍技術以及分子生物學工具整合等方面的不斷突破，玉米單倍體遺傳改良取得了顯著進展，誘導系的效率得到了大幅提升，使得在實驗室條件下更可靠地產生單倍體植株成為可能。同時，通過細胞學方法和分子標記技術準確鑒定單倍體，并利用化學或物理方法促進染色體自然加倍，已形成了一個高效的單倍體育種體系。該技術具有明顯的工程化特征，目前已開始大規模應用[1]。我國在這一領域不斷完善技術、提升效率，每年產出雙單倍體（DH）系數量可達千萬以上，該技術已被列為現代玉米核心育種技術[2]。

1 單倍體誘導系研究進展

玉米首個誘導系Stock6，該誘導系為孤雌生殖，但農藝性狀差，其誘導率平均只有2.52%，自交結實困難[3]，嚴重限制了單倍體技術的發展。經過幾十年的研究和探索，中國農業大學通過將高油玉米育種材料與Stock6進行雜交篩選，得到誘導率達5.80%的誘導系——農大高誘1號[4]，取得較大突破。2007年才卓等[5]育成的吉高誘系3號，其平均誘導率可達10.40%，有明顯的顯色標記，植株整體花粉量大，抗病抗逆性強。中國農業大學2017年通過全基因組測序技術克隆了玉米單倍體誘導基因（ZmPLA1）[6]，發現該基因是最有可能的qhir1區域的候選基因。隨后利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術敲除ZmPLA1進行基因功能驗證，結果顯示ZmPLA1敲除系對測試植株HIR的影響與Stock6相似。2019年Zhong等[7]采用圖位克隆技術，定位了qhir8的候選基因，命名為ZmDMP，同時突變ZmPLA1和ZmDMP，誘導率可達到7.00%。2022年Jiang等[8]解析玉米單倍體誘導關鍵基因發生的分子機制，研究發現，精細胞中活性氧（ROS）增多是誘導玉米單倍體產生的關鍵因素，通過對關鍵因素的剖析，鑒定了一個全新的誘導單倍體發生的新基因ZmPOD65，研發出用化學試劑處理花粉從而誘導單倍體發生的新方法。Chen等[9]通過共表達轉錄因子ZmC1 和ZmR2形成紫胚玉米新種質與高效單倍體誘導系CAU6融合，創制出不受材料背景的影響、單倍體鑒別準確率達99.10%的玉米誘導系MAGIC1（Maize Anthocyanin Gene InduCer 1）和升級版MAGIC2，使得鑒別單倍體胚時間從傳統的授粉后21d縮短到了9d，同時保持了高準確率。玉米單倍體誘導系的不斷創新，使得單倍體誘導過程越來越便捷、單倍體籽粒產出效率越來越高。籽粒高油誘導系、紫根苗誘導系、超前顯色誘導系等一系列改良提升了誘導系在不同環境條件下的適應性，確保誘導效率和鑒定準確率不受地域、季節變化的影響，使該技術能夠在全球范圍內推廣使用。

2 玉米單倍體加倍技術研究進展

2.1 自然加倍法 利用玉米誘導系材料誘導單倍體，通過自然加倍成DH系，是構建玉米DH系的一種操作簡便且快速有效的方法。較早時期Eder等[10]通過試驗證實不同基因型母本誘導率之間有顯著差異，張如養等[11]將不同類群的骨干自交系作為母本材料，利用6個玉米單倍體誘導系對自交系進行誘導，得出6個不同誘導系的誘導率依次為京科誘043（6.06%）gt;京科誘044（5.45%）gt;京科誘045（5.24%）gt;京科誘006（4.11%）gt;京科誘041（2.45%）= 京科誘005（2.45%）。徐國良等[12]以雜交種不同種質的混粉群體及單交種為母本材料，得出不同種質材料的單倍體自交結實率差異較大的結論，Reid群最高為13.01%，Lancaster群較低為2.30%。黎亮等[13]以20個雜交種為母本材料進行單倍體誘導，結果表明高頻材料的單倍體頻率約為低頻材料的5倍。李國良等[14]通過試驗證明農大高誘1號對塘四平頭、旅大紅骨、Lancaster、Reid 四大種質類群和熱導地方種質群的平均誘導率為3.90%，不同類群間存在顯著差異，其中對Reid群誘導率最高，對熱導地方種質類群最低。蔡泉等[15]研究結果表明，5個誘導系（高誘1號、高誘2號、Y01、Y02、Y04）中單倍體誘導率最高的是Y04，達到8.90%，最低的是高誘2號，為6.16%，不同群體間Reid血緣的誘導率較高，5個誘導系平均達到了8.54%，Lancaster血緣的誘導率最低，平均為6.38%。在誘導系實際應用過程中，要根據母本材料類型制定試驗計劃，才能收獲理想DH系株數。

不同地域加倍效果也不同，要根據品種的加倍時間，選擇合適的加倍地點。段民孝等[16]在甘肅、北京、海南3個地方開展玉米自然加倍試驗，結果表明：同一材料自然加倍效率隨著種植地點不同差異明顯，比較有利的時間、地點是甘肅春季播種和海南冬季播種。慈佳賓等[17]在長春、榆樹和白城分別種植同一種玉米基礎材料，研究得出在長春種植加倍率顯著高于榆樹和白城。蔡泉等[18]在海南和黑龍江設4個玉米材料組合加倍，經過驗證，黑龍江平均加倍率（4.42%），海南平均加倍率（7.61%）。

2.2 人工加倍法 人工加倍單倍體過程要使用加倍試劑，考慮藥劑的毒性、對環境的影響和成本因素，一般使用秋水仙素配合助滲劑（二甲基亞砜）以及細胞分裂素等[19]，將秋水仙素濃度控制在0.06%加倍效果最佳。也有研究人員通過使用除草劑達到加倍效果，惠國強等[20]比較了3種除草劑對玉米單倍體成熟胚的加倍效果，發現10μmol/L的甲基胺草磷的效果最好，對先玉335、中地88和鄭單958的加倍率分別為 85.16%、80.20%和 66.30%。

人工加倍方法使用較為廣泛的有浸種、切芽、注射、組織培養加倍等[21]。通過研究不同的加倍方法可提高單倍體技術的應用范圍，文科等[22]對單倍體不同加倍方法進行對比，證明對植株傷害比較嚴重的是浸根法和注射法，加倍效果最好的是浸種法。張坤明等[23]將種子浸泡在秋水仙素溶液中12h表現最佳，其成活率、散粉率、結實率分別達到了78.57%、57.14%、19.64%。王賀等[24]將單倍體種子在秋水仙素溶液（0.07%）中浸芽處理8h，加倍率達16.5%。劉俊等[25]利用秋水仙素溶液（0.06%），使用浸根、滴注心葉、注射生長點的方法分別對單倍體籽粒進行加倍，結果證實注射生長點的方法可以使單倍體成株散粉率和結實率得到提升，平均加倍率達到23%。人工加倍過程中處理方式、藥劑濃度、單倍體籽粒處理時間等因素不同，加倍效果存在較大差異，在加倍過程中要多次嘗試，選擇適合的加倍方案。

3 玉米DH系高效評價方法

由于玉米DH系生產具有階段性，育種家需要短期聚集大量的人員完成階段性工作，因此一些DH系生產服務公司應運而生。DH系生產服務公司的成熟技術，使國內單倍體育種規模越來越大。巨大的生產量，帶來的問題是眾多新生產的DH系如果全部測配，必定浪費較多的人力物力與時間，技術應用的主要瓶頸是DH系大規模生產和材料評價能力之間效率不同，單倍體工程化育種的重點逐步向高效評價DH系轉變，總結部分評價方法如下。

3.1 田間觀察篩選

3.1.1 “兩步法”測配 DH系鑒定評價需要考慮到不同環境和不同品種，評價過程中規劃測試小區的計算方法是DH系數量×測驗種數量×測試環境數量。如每份基礎材料產生1000個DH系，在5個不同生態區，使用3種不同測驗種進行測交，要1.5萬個小區，對很多育種單位來說，土地租賃面積有限，增加測試區域難度較大。為了降低經濟成本，減少土地使用量，可以采取“兩步法”進行選擇，第1年使用一個測驗種在較少地點進行測試，經過篩選后，第2年再利用多個測驗種在多地進行測試[26]。

3.1.2 田間DH系種植篩選 在田間像測試雜交組合一樣高標準種植DH系，對所有DH系實施相同的灌溉、施肥、病蟲害防治措施。組配前后多次觀察、記錄，大量淘汰綜合性狀不符合育種要求的DH系。制定詳細的管理日志，記錄每次操作的時間、方法和用量，確保各處理組之間的一致性。從播種到收獲的全過程中，系統地記錄生長發育指標（株高、分蘗數、開花期等）、產量、品質參數等。利用現代信息技術，如無人機監測、圖像識別等手段，可以提高數據收集的效率和準確性。

3.2 分子檢測篩選 使用雜交F2世代開展單倍體誘導生產DH系比使用F1能夠獲得更多需要的材料。只選擇目標基因F2個體用于DH系的生產，DH系的生產成本和評價成本將大大減少。分子檢測可以作為自交系DH系評價的第一個漏斗[27]，在F2世代誘導可以與分子檢測相結合，通過分子標記技術（如SSR、SNP等）定期對種植的DH系進行遺傳純度驗證，確保植株的基因型保持一致，排除可能的突變或污染。

3.3 玉米DH系高效育種 設計育種正引領著作物育種領域的一場革命[28]，隨著智能設計育種階段的到來，單倍體育種技術結合基因編輯工具（如CRISPR-Cas9）、高通量分子標記、全基因組選擇等[29]，極大地加速了優良性狀的篩選和固定過程，標志著玉米育種進入了前所未有的高效時代。高效育種體系能夠應用的基礎條件需要有以下幾個方面：一定的DH系、高質量的表型鑒定、經濟的基因型分析、可靠的統計建模。開展全基因組選擇育種需要建立統計模型[30]，通過田間數據記載獲得每個個體的性狀表型值，對材料進行基因分型測序，獲得SNP基因型，并估計SNP效應值用于后續分析。高通量分子標記技術讓研究人員能夠大規模地對整個基因組進行掃描，識別與特定性狀相關的遺傳標記，以實現對表型的預測。通過設計育種[31]，使得在早期世代就能預測植株的表現成為可能，提高DH系選擇的準確性，加快了優良基因型的鑒定速度。目前國內科研團隊提出了一種可以降低成本的體系構建思路，育種家根據這些DH系本身的表型，先做篩選，淘汰掉大量有嚴重缺陷的DH系，僅把有希望的DH系做訓練群體檢測基因型，建立統計模型進行篩選。

4 小結與展望

隨著單倍體技術應用過程中各環節技術的不斷完善，該技術已在玉米育種工作中廣泛應用。通過創制材料的DH系，可以增加玉米基礎材料的遺傳多樣性，得到新的突變體。在育種過程中對DH系的需求量增大，需要逐步擴大國內低成本規模化DH系生產系統，整合數據分析技術，建立高通量DH系評價，形成智慧育種新模式，縮短育種周期，構建玉米高效育種材料選擇體系，促進玉米商業化育種進入精準化的新階段，推動現代種業與人工智能、大數據等前沿科技深度融合，更快地響應市場需求和環境變化，為全球糧食安全和可持續發展貢獻力量。

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（收稿日期：2024-06-11）

基金項目：安徽省重點研究與開發計劃（2023n06020023）

通信作者：崔明亮