??一株具有殺松材線蟲活性的馬尾松內生菌分離及鑒定?

摘要：為獲得具有殺松材線蟲活性的菌株，在湖南省瀏陽市采集了健康馬尾松、感染松材線蟲病但尚未死亡的馬尾松以及感染松材線蟲病致死的馬尾松材料，從中分離得到了27株內生細菌進行殺線活性的測定，并對高效拮抗菌株進行了鑒定。結果表明：從感染但尚未死亡的松樹分離得到的細菌H-4都具有較高的殺線活性；在發酵液處理48 h后，菌株H-4的殺松材線蟲活性最高，松材線蟲校正死亡率和消解率分別達到97.1%和89.2%。綜合考慮菌株H-4的形態學特征、生理生化測定結果以及16S rRNA系統發育樹分析結果，確定菌株H-4為暹羅芽孢桿菌。

關鍵詞：松材線蟲；內生細菌；暹羅芽孢桿菌

中圖分類號：S763 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）09-0073-05

Isolation and Identification of an Endophyte with Killing Effect on Pine Wood Nematodes from Pinus massoniana

HUANG Wen-jing1，LI Zhen1，XIA Yong-gang2，TAN Ze-bao1，XIAO Qin1，ZHU Huan-wu1，LUO Kun1

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Academy of Forestry，

Changsha 410018， PRC）

Abstract： To obtain the strains capable of killing pine wood nematodes， we collected the healthy plants， the plants infected with pine wood nematodes but still alive， and the plants infected with pine wood nematodes and dead of Pinus massoniana from Liuyang City， Hunan Province. A total of 27 strains of endophytic bacteria were isolated and subjected to assessment of their nematocidal effects. Furthermore， the efficient antagonistic strains were identified. The results showed that strain H-4 isolated from the infected but still alive plants exhibited a high nematocidal activity. The treatment with the fermentation broth of strain H-4 for 48 h achieved the highest killing effect on pine wood nematodes， with the corrected mortality and clearance rates of pine wood nematodes reaching 97.1% and 89.2%， respectively. Strain H-4 was identified as Bacillus siamensis according to the morphological， physiological， and biochemical characteristics and the phylogenetic tree built based on the 16S rRNA sequence.

Key words： pine wood nematode; endophytic bacteria; Bacillus siamensis

松材線蟲病，又稱松樹萎蔫病（Pine wilt disease，

PWD），是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的具有毀滅性的的森林檢疫性病害[1]。1982年，我國在江蘇省南京市中山陵的黑松上首次發現松材線蟲病[2]。松材線蟲病傳染性強、危害重[3]，據2022年的數據統計，松材線蟲病覆蓋19個省，發生面積達151.15萬hm2[4-5]。松材線蟲的防治包括物理防治、化學防治和生物防治。物理防治對控制技術要求高，使用范圍相對較窄[6]；化學防治容易造成有害物質殘留，且易導致植物產生抗性。因此，松材線蟲的生物防治備受關注[7-8]。

植物內生菌和宿主植物聯系緊密[9]。研究發現，植物內生菌具有殺線蟲、抗病菌、抗氧化和分解糖類的作用[8，10]。例如：從松樹內提取的內生真菌Esteya vermicola具有很強的殺線蟲活性[11]，說明部分松樹的內生菌對松材線蟲病存在抗性。松樹內生菌在松材線蟲病的抑制防控方面具有巨大的潛力[12]，有望為松材線蟲病的生物防治提供新的方法[5，13]。而且，相較化學防治而言，利用內生菌進行防治更符合現代農業防治的要求，因而近年來已成為生防菌劑開發的熱點[14]。該研究在湖南省瀏陽市采集了健康馬尾松、感染松材線蟲病但尚未死亡的馬尾松以及感染松材線蟲病致死的馬尾松材料，對其內生菌進行分離鑒定，探究從不同材料提取的內生菌對松材線蟲的殺線蟲活性，以期為松材線蟲病的生物防治提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在湖南省瀏陽市葛家鎮的松材線蟲感染區采集健康馬尾松、感染松材線蟲病但尚未死亡的馬尾松以及感染松材線蟲病致死的馬尾松作為試驗材料；供試松材線蟲由中國農業科學院蔬菜花卉研究所的茆振川課題組提供；培養基包括牛肉膏蛋白胨固體培養基（NA）、牛肉膏蛋白胨液體培養基（NB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和LB固體培養基。

1.2 研究方法

1.2.1 內生菌株的分離純化 采用組織培養法對馬尾松內生菌株進行分離純化。去除采集的馬尾松樹干的外表層，每種材料取2 cm×2 cm的木質組織薄片5片，75%酒精浸泡1 min，6%次氯酸鉀浸泡1 min，

無菌水沖洗3次，進行表面消毒。將消毒后的材料剪成2 mm×2 mm的小木塊，每5塊為1組，均勻放置于PDA和LB培養基中，每種樣品接種3個平板。將平板置于28℃的恒溫培養箱中，黑暗條件下培養，當木塊周圍長出菌落時，用接種環挑取少量菌落在新的PDA和LB培養基平板上劃線培養，多次重復此操作，直至單菌落出現。

1.2.2 內生菌株培養液的制備 將純化好的內生菌株分別接種至50 mL的NB培養基中，在28℃、160 r/min條件下培養3 d，得到菌株發酵液。將菌株發酵液在4℃、8 000 r/min條件下離心10 min，將離心后的上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到菌株發酵濾液[15-16]。

1.2.3 松材線蟲懸浮液的制備 在超凈工作臺中，將灰葡萄孢菌餅倒置接種在PDA培養基平板中，在28℃培養箱中倒置培養7 d。當菌絲長滿平板時，再接種松材線蟲[17]。灰葡萄孢菌絲被松材線蟲完全取食后，用無菌水清洗平板，以收集平板中的松材線蟲，混合后配制成濃度為5 000條/mL的線蟲懸液[15，18]。

1.2.4 松材線蟲拮抗細菌的篩選 分別取200 μL NB培養基（CK）、內生菌發酵液加至細胞培養板中，然后各加入200 μL線蟲懸浮液（約1 000條線蟲），搖晃均勻，每個處理重復3次[19]。在室溫下避光靜置48 h后分別吸取50 μL混合溶液（約125條線蟲）在顯微鏡下觀察松材線蟲存活情況并計數[20]，計算校正死亡率和消解率[15，21-22]。利用相同方法對篩選出的高效拮抗菌株的發酵液、發酵濾液進行試驗，分別處理24、48 h后，計算校正死亡率和消解率。

1.2.5 拮抗細菌的鑒定 對篩選出的拮抗細菌進行菌株大小、邊緣、形狀和顏色等表面特征的觀察，并對其進行革蘭氏染色，測定其生理生化指標[23-24]。參照賀麗娜等[23]的方法，以細菌通用引物序列進行PCR擴增。取部分PCR產物檢測有無條帶，出現目的條帶后委托北京擎科生物科技股份有限公司進行測序；獲得測序序列后，使用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹[22]。

2 結果與分析

2.1 內生菌的分離純化及其殺線蟲活性測定

采用組織分離法從健康、感染松材線蟲病但尚未死亡和感染松材線蟲病致死等3種馬尾松莖桿材料內分別分離得到5、9、13株細菌。對分離得到的27株細菌的發酵液進行初步的殺線活性測定，發現從感染但尚未死亡的馬尾松分離得到的細菌H-4的殺線活性最高（表1）。選取殺線能力最強的細菌H-4開展后續試驗，對H-4的發酵液、發酵濾液進行殺線活性測定。由表2可知，細菌H-4發酵液的校正死亡率和消解率均高于對應的發酵濾液。發酵液靜置處理48 h后，松材線蟲的校正死亡率和消解率分別達到97.1%和89.2%。菌株H-4發酵液處理48 h后，可以發現松材線蟲蟲體形態發生明顯變化，體壁被溶解，顯微鏡視野已觀察不到完整的線蟲蟲體（圖1）。

2.2 細菌H-4的鑒定

2.2.1 形態學特征與生理生化測定 蘸取H-4菌液在LB固體平板上劃線，在細菌恒溫培養箱培養24 h后，觀察其菌落形態（圖2），發現H-4菌落表面光滑、呈圓形、乳白色、有黏性且不透明。進行生理生化測定發現，H-4的V-P測定、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解和纖維素酶試驗呈陽性，甲基紅、硫化氫、溶磷和蛋白酶試驗呈陰性。

2.2.2 細菌H-4 16S rRNA測序分析 菌株H-4的序列總長為1 880 bp，PCR產物電泳檢測結果如圖3所示。根據測序結果構建系統發育樹，由圖4可知，菌株H-4與芽孢桿菌屬（Bacillus）關系較近密切，并且與暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）的相似性最高；再綜合考慮菌株H-4的形態學特征和生理生化測定結果，確定菌株H-4為暹羅芽孢桿菌。

3 討論與結論

松材線蟲病不僅嚴重威脅松林生態系統，而且會造成巨大的經濟損失和不可估量的生態損失[25-28]。松材線蟲病會受到環境條件與人類活動等各種因素的影響[29]，松材線蟲可以通過松墨天牛進行遠距離傳播，生存定殖造成寄主植物的枯萎死亡[30]。松材線蟲病嚴重影響了林業發展，至今仍難以對其進行全面而有效的控制[31-32]。研究發現，一些真菌、細菌對松材線蟲有抑殺性，能有效防治松材線蟲病[33-34]，

而且，生物防治是目前較為環保且有效的一種防治手段[35-36]。

Shanmugam等[37]分離出一株具有殺松材線蟲活性的內生細菌Raoultella ornithinolytica MG，并發現該菌株存在一些可能與殺線蟲活性相關的基因。Marques-Pereira等[38]發現，某些沙雷氏菌的發酵上清液和特定的氨基脂質對松材線蟲有較高的殺線蟲活性。李恩杰等[39]篩選到一株對松材線蟲有較高殺滅活性的蘇云金芽孢桿菌，且該菌株的發酵液具有較好的熱穩定性。此外，還有研究發現某些貝萊斯芽孢桿菌[40]、放線菌[41]、真菌[42]也對松材線蟲具有較高的殺滅活性。

該研究從3種松樹材料中分離純化得到27株細菌，發現從感染但尚未死亡的松樹分離得到的細菌H-4具有較高的殺線蟲活性。菌株H-4發酵液處理48 h時殺線活性最高，通過顯微鏡進行觀察，可以發現部分線蟲發生了溶解，其內含體流出，推測菌株H-4發酵液中的某種物質可以破壞松材線蟲的體壁。發酵液中的次生代謝物質復雜，后續研究中考慮對其進行分離純化，探究發酵液對線蟲的抗性機制。

利用松樹內生菌對松材線蟲病進行預防和控制，可以為松材線蟲病的防治提供新的微生物資源[43]，也有利于擴大生物防治技術的使用面。鑒于菌株H-4是從感染但尚未死亡的松樹中分離出來的，推測提高該細菌在松樹內的豐度可以提高松樹對松材線蟲病的抗性，或者使感病松樹恢復健康狀態。該研究采集的松樹材料來自湖南地區，分離得到的細菌H-4可能主要針對湖南地區流行的松材線蟲病，其對其他地區的松材線蟲病的抑制情況仍有待探究。

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（責任編輯：王婷）