奶山羊臨床型乳房炎病原菌的分離鑒定與耐藥分析

摘 要：對采集的43份乳樣進行病原菌的分離培養、鑒定和耐藥性分析。結果表明，乳樣中共分離出6種61株病原菌，其中大腸桿菌21株，占34.4%；金黃色葡萄球菌17株，占27.9%；凝固酶陰性葡萄球菌11株，占18.0%；無乳鏈球菌7株，占11.5%；乳房鏈球菌3株，占4.9%；綠膿桿菌2株，占3.3%；表明該地區主要病原菌依次為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌。藥敏試驗顯示，主要病原菌菌株對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、紅霉素、萬古霉素具有重度或中度耐藥，對頭孢唑啉、阿米卡星、頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星等敏感。

關鍵詞：奶山羊；乳房炎；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號：S852" 文獻標識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）11-0094-04

收稿日期：2024-08-09 修回日期：2024-09-16

基金項目：渭南職業技術學院重點科研項目（項目編號：WZYZ202103）。

第一作者簡介：李娟娟（1982-），女，副教授，執業獸醫師，碩士，主要從事動物疾病防治和畜牧獸醫專業動物微生物課程教學工作。

Isolation， Identification， and Antibiotic Resistance Analysis of Clinical Mastitis Pathogens in Dairy Goats

LI Juanjuan，WEI Heng

（Weinan Vocational And Technical College，Weinan， Shaanxi" 714026，China）

Abstract：In order to understand the main pathogenic bacteria and drug resistance of clinical mastitis in the dairy goat breeding area of Fuping County， Weinan City.And provide a basis for the prevention and treatment of this disease in the local area， 43 milk samples were collected for pathogen isolation， cultivation， identification， and drug resistance analysis.The results showed that a total of 61 strains of 6 pathogenic bacteria were isolated from the milk sample， including 21 strains of Escherichia coli， accounting for 34.4%; 17 strains of Staphylococcus aureus， accounting for 27.9%; 11 strains of coagulase negative Staphylococcus， accounting for 18.0%; 7 strains of Streptococcus agalactiae， accounting for 11.5%; 3 strains of Streptococcus pyogenes， accounting for 4.9%; Two strains of Pseudomonas aeruginosa， accounting for 3.3%; This indicates that the main pathogenic bacteria in the region are Escherichia coli， Staphylococcus aureus， and coagulase negative Staphylococcus.The drug sensitivity test showed that the main pathogenic bacterial strains have severe or moderate resistance to penicillin， ampicillin， streptomycin， erythromycin， vancomycin， and are sensitive to cefazolin， amikacin， ceftriaxone， gentamicin， ciprofloxacin， etc.

Key words：dairy goats；mastitis；isolation and identification；drug sensitivity test

渭南市富平縣被譽為全國“奶山羊之鄉”，目前奶山羊存欄量達58萬只，養羊業已成為該地區重點產業之一。為了解引起該地區奶山羊乳房炎病原菌種類和耐藥性，對該地區奶山羊養殖場或養殖戶發病的臨床型乳房炎病例采集乳樣進行分離鑒定和耐藥分析，為該病的預防和治療提供合理依據，以促進養羊業的健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳樣 以渭南市富平縣奶山羊養殖場或養殖戶為對象，選取患臨床型乳房炎且未經抗菌素治療的患病羊，無菌采集乳樣43份。采前溫水洗凈乳頭，然后用0.1%新潔爾滅溶液消毒。棄去頭3把奶，采集乳樣8～10 mL置無菌試管中，膠塞密封，標記信息，低溫保存送微生物實驗室檢測。

1.1.2 儀器 高壓蒸汽滅菌器，電熱恒溫培養箱，冰箱，移液器，超凈工作臺，生物顯微鏡，電子天平等。

1.1.3 培養基及試劑 培養基和生化鑒定試劑均購于青島高科技工業園海博生物技術有限公司，藥敏試紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養 將采集的乳樣充分搖勻，分別接種于血液瓊脂、普通瓊脂和麥康凱瓊脂培養基，并作好信息標記，37℃培養24～48 h，觀察菌落。依據培養菌落形態特征，選取典型菌落純化培養[1] 。

1.2.2 病原菌的形態鑒定 觀察純化培養菌落特征、溶血狀況。革蘭氏染色，顯微鏡觀察病原菌大小、形態、著色、排列方式等。初判病原菌類別。

1.2.3 病原菌生化鑒定 球菌的鑒定：開展葡萄糖發酵試驗、觸酶試驗、馬尿酸鈉水解試驗、凝固酶試驗、乳糖發酵試驗、甲基紅試驗、二乙酰試驗、CAMP試驗、七葉苷發酵試驗[2]。

桿菌鑒定：開展硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、葡萄糖發酵試驗、麥芽糖試驗、二乙酰試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、氧化酶試驗、硫化氫試驗、甲基紅試驗[2]。

1.2.4 藥敏試驗 采用紙片擴散法，選用抗菌素對鑒定后的主要病原菌進行藥敏試驗。方法為挑取純培養的菌落用無菌生理鹽水稀釋至0.5個麥氏單位的菌濃度，無菌槍頭吸取0.1mL置于相應培養基表面，用滅菌棉簽均勻涂布，室溫放置數分鐘。然后將藥敏試紙片放置培養基表面，輕壓試紙使其與培養基貼合緊密，每個培養基貼4片，37℃培養24 h，依據藥敏片判定標準，記錄結果。

2 結果分析

2.1 細菌分離培養和染色結果

分離純化后的病原菌菌株在不同培養基上培養呈現不同菌落特征，結合革蘭氏染色情況和鏡檢觀察，結果分為A類、B類、C類和D類菌落，具體見表1。

2.2 細菌的生化鑒定結果

43份乳樣中，有41份乳樣分離出6種61株病原菌；未檢出病原菌的2個乳樣，可能為其它病原微生物或因素引起。生化鑒定出的菌株中，A類菌落分別為金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌；B類菌落分別為無乳鏈球菌、乳房鏈球菌；C類菌落為大腸桿菌；D類菌落為綠膿桿菌。生化試驗結果見表2、表3、表4、表5。

分離鑒定出的 61株病原菌中，大腸桿菌21株占34.4%；金黃色葡萄球菌17株占27.9%；凝固酶陰性葡萄球菌11株占18.0%；無乳鏈球菌7株占11.5%；乳房鏈球菌3株占4.9%；綠膿桿菌2株占3.3%。說明渭南市富平縣奶山羊該病的主要致病菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和凝乳酶陰性葡萄球菌。

2.3 藥敏實驗結果

依據藥敏片抑菌圈判定標準，藥敏試驗結果表明鑒定出的病原菌菌株對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、紅霉素、萬古霉素等藥物表現重度或中度耐藥。其中大腸桿菌對頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢唑啉敏感；金黃色葡萄球菌對頭孢唑啉、阿米卡星敏感；凝固酶陰性葡萄球菌對環丙沙星、慶大霉素、復方新諾明、頭孢曲松等敏感；無乳鏈球菌對頭孢唑啉、萬古霉素、環丙沙星敏感；乳房鏈球菌對紅霉素、頭孢唑啉、頭孢曲松、環丙沙星敏感；綠膿桿菌對頭孢曲松、環丙沙星敏感。對于藥物的敏感性，同種病原菌的不同菌株具有相似性，不同病原菌對同一藥物的敏感性有所差異。藥物敏感性結果見表6。

3 結論

引起渭南市富平縣奶山羊臨床型乳房炎的致病菌主要為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和凝乳酶陰性葡萄球菌；主要致病菌對頭孢唑啉、阿米卡星、頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星等敏感，對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、紅霉素、萬古霉素具有重度或中度耐藥。

4 討論

本研究采集了43份臨床型乳房炎患病羊乳樣，從41份乳樣分離出6種61株病原菌，其中大腸桿菌21株占34.4%；金黃色葡萄球菌17株占27.9%；凝固酶陰性葡萄球菌11株占18.0%；無乳鏈球菌7株占11.5%；乳房鏈球菌3株占4.9%；綠膿桿菌2株占3.3%。41份乳樣中有13份乳樣的病原菌存在混合感染，占比31.7%。因此，引起該病致病菌主要為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌。2份乳樣未分離出病原菌，可能是由其它病原微生物、非特異性因素引起，或者患病羊自身的免疫機能消除了乳腺中的致病菌，損傷的組織沒有恢復所引起。邱芳對富平縣奶山羊養殖場采集的乳樣進行病原菌的分離鑒定，結果顯示致病菌為葡萄球菌（37.58%）、大腸埃希菌（20.14%）、芽孢桿菌（7.38%）、克雷伯桿菌（6.71%）、變形桿菌（6.71%）[3]。謝曉燕從富平縣和隴縣采取乳樣進行病原菌分離鑒定，得出病原菌為大腸桿菌（33.3%）、金黃色葡萄球菌（25.9%）、蠟狀芽孢桿菌（13.0%）、綠膿桿菌（11.1%）、無乳鏈球菌（7.4%）和凝固酶陰性葡萄球菌（5.6%）[4]。本試驗結果與邱芳、謝曉燕對奶山羊乳房炎分離鑒定的主要致病菌基本一致，存在差異的原因可能是不同養殖場或養殖戶養殖環境、飼養管理和擠奶方式存在不同，也可能是在疾病發生后用藥種類不同，致使奶山羊對不同致病菌產生不同的抵抗力；還可能是不同養殖區域存在不同致病菌

所致[5～7]。混合感染的原因與養殖場環境條件和擠奶方式有很大關系，也可能是患病羊繼發感染引起。

藥敏試驗結果分析來看，該地區主要致病菌對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、萬古霉素、紅霉素等藥物呈現重度或中度耐藥性。其中大腸桿菌對頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢唑啉等依次敏感；金黃色葡萄球菌對頭孢唑啉、阿米卡星敏感；凝固酶陰性葡萄球菌對環丙沙星、慶大霉素、復方新諾明、頭孢曲松等依次敏感。不同地區奶山羊乳房炎致病菌對藥物的敏感性存在差異性，可能與本地區致病菌的變異情況和當地技術人員的用藥習慣、用藥劑量、防治方法等有很大關系。因此，為控制本病的發生，不同地區應對致病菌進行藥敏試驗，防治選用敏感藥物，同時注意交替用藥，避免致病菌耐藥性的發生。

參考文獻：

[1] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：132-134.

[2] 中國科學院微生物研究所翻譯組譯.伯杰細菌鑒定手冊（第八版）[M].北京：科學出版社， 1984.

[3] 邱芳.奶山羊乳房炎主要致病菌的分離鑒定及藏藥對其抗菌活性研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2022.

[4] 謝曉燕.奶山羊乳房炎病原菌分離鑒定及多重PCR檢測方法建立[D].楊凌：西北農林科技大學，2017.

[5] da """"" Silva E R.Coagulase gene polymorphism of Staphylococcus aureus isolated from goat mastitis in Brazilian dairy herds[J].Microbiology，2006，42（1）：30-34.

[6] 邵鉞馨，謝洋洋，張新鈺，等.關中地區規模化奶山羊養殖場機器擠奶現狀及建議[J]，家畜生態學報，2021，42（1）：79-82，96.

[7] Kuang Y，Tani K.Characterization of bacterial population of raw milk form bovine mastitis by culture-independent PCRDGGE method[J].Biochem Engineering J，2009，45（1）：76-81.