棉田不同菌型棉蚜體內微生物多樣性分析

摘要：【目的】研究不同菌型棉蚜體內微生物種類與豐度的差異。【方法】通過HiSeq平臺對不同菌型棉田棉蚜體內共生菌的16S rRNA基因V3～V4區進行高通量測序，分析綠盲蝽體內共生菌的種類與多樣性。【結果】對照組與沙雷氏菌型、漢密爾頓菌型棉蚜的優勢菌門均為變形菌門，相對物種豐度分別占97.42%、95.55%和92.78%。對照組與試驗組的優勢菌科均為腸桿菌科，但相對豐度有所差異，相對豐度分別占96.14%、81.285%和84.22%。漢密爾頓菌型棉蚜與沙雷氏菌型棉蚜其體內漢密爾頓菌屬與沙雷氏菌屬微生物豐度與對照組相比顯著升高，分別占比77.40%和12.04%。【結論】棉田中含有沙雷氏菌與漢密爾頓菌的棉蚜其體內微生物豐度受到顯著影響，其體內漢密爾頓菌屬與沙雷氏菌屬相對豐度顯著上升。

關鍵詞：16S rRNA；棉蚜；微生物；沙雷氏菌；漢密爾頓菌

中圖分類號：S435.62文獻標志碼：A文章編號：1001-4330（2024）09-2277-08

0引 言

【研究意義】昆蟲中含有豐富的微生物種類，可占昆蟲生物量的1%～10%，兩者之間有著密不可分的關系。昆蟲體內的微生物可以直接影響宿主體內多種生命活動［1］。微生物可以影響宿主與其他個體之間的接觸，微生物在昆蟲體內有選擇的為宿主的適應性提供幫助，增強其在個體之間的傳播效率，這些微生物通過改變昆蟲之間接觸時的信號素決定昆蟲配偶的選擇或者與其他個體接觸［2］。微生物還可以為宿主提供一些必需的氨基酸、維生素等營養物質，幫助宿主占據較高的生態地位，這些功能在刺吸式害蟲胞內原生共生菌與宿主協同進化中發揮了重要作用［3，4］。微生物與昆蟲之間存在著密切的關系。【前人研究進展】不同的昆蟲與其攜帶的共生細菌存在多種互利關系。昆蟲攜帶的共生菌分為初級共生菌和次級共生菌，又稱孤雌共生菌。初級共生菌在昆蟲的生長發育中發揮著重要作用，初級共生菌Buchnera與蚜蟲共生，已成為蚜蟲不可分割的一部分［5］，而當蚜蟲喂食缺乏VB的食物時，含有Buchnera的蚜蟲比不含Buchnera的蚜蟲更能滿足正常生長發育的要求［6］。次生共生菌遍布宿主體腔、腸道和脂肪體的神經和肌肉組織，如黑蠅中的立克次體分布于整個體腔，以及中腸［7］。目前在蚜蟲中發現的主要次生共生菌有9種，包括Hamiltonella defensa，Regiella insecticola，Serratia symbiotica，Rickettsia，Spiroplasma，Rickettsiella，PAXS Arsenophonus，Wolbachia pipientis［8-15］。漢密爾頓菌可以保護宿主免受寄生黃蜂的寄生［15］。次生共生細菌還可以改變宿主對不利環境的適應能力，從而保護其種群規模。例如，當豌豆蚜細胞在高溫環境下含有沙雷氏菌和立克次體時，宿主對高溫的敏感度明顯低于不含該2種共生菌的豌豆蚜［16］。【本研究切入點】棉蚜（Aphis gossypii Glover），是一種雜食性農業害蟲，屬于半翅目（Hemiptera）蚜科（Aphididae），直接或間接危害寄主植物。當棉蚜吸取植物汁液獲取養分時，將引起植物葉片枯萎甚至壞死，進而影響植物的生存，使植物的產量和品質下降［17］。棉蚜分泌物在植物上的分布也阻礙了光合作用和呼吸作用，也為真菌菌絲體的生長創造了條件，將導致棉花黑霉病的發生［18］。棉蚜還可以間接充當多種植物病毒傳播的載體［19］。

在生物防治探索過程中，昆蟲體內的共生菌與昆蟲抗性密切相關［20-22］。當昆蟲感染沃爾巴克氏體和立克次體時，這些生物體對殺蟲劑的敏感性通常會增加［23］。然而，感染相同共生菌的昆蟲對不同農藥的抗藥性不同。感染沃爾巴克氏體的粉虱對啶蟲脒和多殺菌素的耐藥性顯著增加，但對百倍硫磷的耐藥性無明顯增加的趨勢［24］。同樣，立克次體侵染昆蟲的功能增強了煙螨對啶蟲脒的抗藥性，但對地芬太尼的抗藥性無變化［24，25］。

因此，棉花種植過程中需要積極防治棉蚜。由于棉蚜世代數多、每年發生次數多［20］，因此生物防治是較好的選擇。【擬解決的關鍵問題】通過HiSeq平臺對不同菌型棉田棉蚜體內共生菌的16S rRNA基因V3～V4區進行高通量測序，測定微生物的類型和豐度，分析共生菌與微生物之間的群落結構關系，為害蟲綠色生物防治策略提供參考。

1材料與方法

1.1材 料

棉蚜采集于中國農業科學院棉花研究所東場試驗田棉花植株（安陽縣，36° 5′34.8″ N，114° 31′47.19″ E）在人工智能光照培養箱（（26±1）℃，L∶D=14∶10 h，RH = 70%±5%）中飼養，建立種群。根據文獻特異性引物［26］，采用QPCR方法檢測單頭棉蚜體內的共生菌的感染情況。沙雷氏菌［16，27，28］和漢密爾頓氏菌［29，30］在抵抗天敵的過程中發揮著重要作用。篩選出蚜蟲體內優勢菌為沙雷氏菌（B）、漢密爾頓菌（C）的棉蚜進行擴繁。

1.2方 法

1.2.1試驗設計

設置對照組（A），對照組棉蚜為體內所有類型共生菌拷貝數均低于水的種群。

1.2.2DNA的提取

提取DNA之前，先用75%酒精和紫外燈對試驗臺進行消毒，準備好試劑和耗材備用。將收集好的蚜蟲樣本用75%酒精消毒30 s，使用滅菌后的ddH2O反復洗滌3次，將殘余酒精完全沖洗干凈，用移液器將剩余的ddH2O吸出，放入冰盒備用。蚜蟲體表消毒完成后，使用Fast DNA@SPIN Kit for Soil試劑盒提取蚜蟲樣品的總DNA。2種菌型和對照組的蚜蟲分別設置5個重復，以及1個對照均在生物安全柜中操作。

1.2.3數據庫建立

用簡并PCR引物341F（5′-ACTCCTACGGGGAGGGCAGAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴增細菌16S rRNA基因的可變區V3-V4。正向和反向引物均標記有Illumina適配器、pad和連接子序列。在含有30 ng模板、融合PCR引物和PCR主混合物的50 μL反應中進行PCR富集。PCR循環條件如下：94℃循環3 min，30次94℃循環30 s，56℃循環45 s，72℃循環45 s，最后在72℃條件下延長10 min，持續10 min。PCR產物用Amplexp珠純化并在洗脫緩沖液中洗脫。庫由安捷倫2100生物分析儀（安捷倫，美國）鑒定。在Illumina MiSeq平臺（中國深圳BGI）上，按照Illumina的標準管道，使用經驗證的文庫進行測序，并生成2×300 bp配對末端讀碼。

1.3數據處理

對原始讀取進行過濾，以去除適配器和低質量且不明確的堿基，通過快速長度調整短讀取程序（FLASH，v1.2.11）［31］將成對的末端讀取添加到標簽中，以獲得標簽。使用UPARSE軟件（v7.0.1090）［32］將這些標簽聚集到截止值為97%的OTU中，并使用UCHIME（v4.2.40）［33］將嵌合序列與Gold數據庫進行比較。之后，使用核糖體數據庫項目（RDP）分類器v.2.2對OTU代表性序列進行分類，最小置信閾值為0.6，并由QIIME v1.8.0［34］在綠色基因數據庫v201305上進行訓練。使用USEARCH_global［35］將所有標簽與OTU進行比較，得到每個樣本的OTU豐度統計表。α和β多樣性分別由MOTHUR（v1.31.2）［36］和Qime（v1.8.0）［34］在OTU水平上估算。樣本聚類由QIIME（v1.8.0）［34］基于UPGMA進行。使用PICRUSt軟件［37］預測KEGG和COG函數。用R軟件包v3繪制了不同分類級別的條形圖和熱圖。分別為4.1和R包“gplots”。

2結果與分析

2.116S rRNA基因測序結果概述

研究表明，共獲得1 610 899條拼接序列，拼接序列的平均長度為253 bp。基于97%的物種相似性，將拼接標簽聚類到OTU中，測序數量的質量和可信度。圖1

對照組的Chao指數與ACE指數大部分低于試驗組（反映樣品中群落的豐富度），試驗組的微生物豐度均高于對照組，測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種，不存在未被測序檢測到的物種。對照組的Shannon指數均低于試驗組，而Simpson指數均高于試驗組，反映群落的多樣性，不同菌型棉蚜群落微生物多樣性高于對照種群。Coverage對所有樣本的覆蓋率均在99%以上。表1

2.2不同菌型棉蚜體內微生物在門水平上的群落組成

研究表明，對照組與試驗組的優勢菌門均為變形菌門，沙雷氏菌型、漢密爾頓菌型棉蚜種群中的優勢菌門相對物種豐度占比分別為95.55%和92.78%，對照組的相對物種豐富度占97.42%。其中C組樣本中，藍藻門的相對豐度顯著高于其他樣本，占6.73%。圖2

2.3不同菌型棉蚜體內微生物在科水平上的群落組成

研究表明，在科水平上，對照組與試驗組的優勢菌科均為腸桿菌科，但相對豐度有所差異，A、B、C三組中腸桿菌科的相對豐度分別占96.14%、81.285%和84.22%。且與試驗組相比，對照組中除腸桿菌科外，其他菌門所占比例均低于2個試驗組。圖3

2.4不同菌型棉蚜體內微生物在屬水平上的群落組成

研究表明，測序樣本在屬水平的差異性顯著，其中，對照組、沙雷氏菌菌型的棉蚜種群優勢菌屬均為布赫納氏菌屬，相對豐度分別占84.17%、62.10%，漢密爾頓菌型棉蚜種群優勢菌屬為漢密爾頓菌屬，物種豐富度占77.40%，布赫納氏菌屬的相對豐度僅占6.78%。B組中沙雷氏菌屬物種豐富度顯著上升，占12.04%。圖4

2.5不同微生物型棉蚜體內微生物多樣性比較

研究表明，不同菌型棉蚜體內微生物特有的微生物種類數量，A、B、C 3組樣本中注釋到的OTU種類數目分別為357、440和283，相同的OTU數量為151。沙雷氏菌型的棉蚜微生物種類數目最多，且樣本中特有的OTU數量也是最高的一組，數量為135。漢密爾頓菌型的棉蚜微生物種類數量最少，OTU數量為283，且特有OTU數量為39，是所有樣本中最少的。圖5

對所有微生物群落進行PCA分析。樣品中，微生物群落越相似，在坐標中距離越近，PC1所占比例為59.01％，PC2所占的比例為16.13％，兩者總占比75.14％，PC1和PC2總微生物群落差異的75.14％。A和B 二組樣品中的微生物群落相似度較高，和C組的微生物群落距離較遠，存在顯著差異。沙雷氏菌型棉蚜與對照組棉蚜微生物群落組成相似，其微生物群落結構和漢密爾頓菌型所構成的差異明顯。圖6

3討 論

3.1

微生物普遍存在于昆蟲體內，其中共生菌除了在昆蟲的營養和發育中發揮重要作用外，共生菌還能產生一些生物活性化合物，保護宿主免受不利環境條件、捕食者或競爭對手的侵害［38］，試驗研究中，通過篩選不同菌型棉蚜并對含有沙雷氏菌、漢密爾頓菌型的棉蚜種群進行16S rRNA高通量測序分析，結果表明，含有該3類不同菌型的棉蚜與對照組相比，其優勢菌門均為變形菌門。但所占比例略有差異，分別為97.6%、93.7%和90.6%。昆蟲體內微生物的優勢菌門以變形菌門或厚壁菌門為主。例如，鞘翅目的天牛Saperda vestita Say［39］，雙翅目的地中海實蠅Ceratitis capitata Wiedemann［40］等，與試驗研究測序結果是一致的。在科水平上，對照菌群與3個樣本的優勢菌群菌為腸桿菌科。在屬水平上對照組與沙雷氏菌型的棉蚜優勢菌群均為布赫納氏菌屬，分別占比81.2%、64.5%，其優勢菌屬為漢密爾頓菌屬，相對豐度為77.5%，與其他群體形成顯著差異。

棉蚜體內的優勢共生菌在不同地方具有很大差異，在我國北方，自然棉蚜種群中優勢菌屬為布赫納氏菌屬、殺雄菌屬、漢密爾頓菌屬和不動桿菌屬［41］。布赫納氏菌、殺雄菌、不動桿菌為優勢菌，其他共生菌的相對豐度均在0.5%以下，但有些蚜蟲體內的優勢菌還包括漢密爾頓菌，如扁蚜科［42］。在南美地區，蚜蟲種群中兼性共生菌結構組成包括沙雷氏屬、漢密爾頓菌、殺雄菌［43］。在法國，蚜蟲體內共生菌占主導地位的包括螺原體屬、立克次氏體，布赫納氏屬，其他共生菌相對豐度小于2%［44］。在日本豌豆蚜中，共生菌群落組成為布赫納氏屬、沙雷氏屬、R.insecticola（PAUS，U型）、立克次氏體、螺原體屬［45］。試驗的3個樣本中，篩選出以漢密爾頓菌為優勢菌的棉蚜種群其漢密爾頓菌屬的相對豐度顯著高于對照組，布赫納氏菌屬與對照相比顯著下降，根據前人的研究結果，辛硫磷處理后的棉蚜微生物群落發生了變化，布赫納氏菌相對豐度降低和漢密爾頓菌豐度升高［41］，漢密爾頓菌對布赫納氏菌豐度具有負面影響，與試驗研究測序結果完全吻合。布赫納氏菌是蚜蟲體內的初級共生菌，與蚜蟲的生命活動緊密相連，Buchnera共生菌能合成蚜蟲必須的氨基酸，這些氨基酸是蚜蟲生長發育與繁殖必不可少的［46］，失去原生共生菌的蚜蟲生長發育變遲緩，生殖能力降低甚至完全喪失［47］。

3.2

昆蟲體內的共生菌對昆蟲的抗性增強會發揮很大的作用，包括次級共生菌，其中漢密爾頓菌就是一個典型的例子，通過阻止寄生蜂的發育來保護蚜蟲免受寄生蜂的侵擾［48］。感染Hamiltonella的小麥蚜蟲對殺蟲劑敏感性降低［49］。原因是低豐度的漢密爾頓菌感染可以通過增加宿主體的解毒酶活性，從而降低蚜蟲對殺蟲劑的敏感性［49］，漢密爾頓氏菌感染的蚜蟲抑制了植物中水楊酸和茉莉酸相關的防御途徑，抑制多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，參與植物防御反應［50］。

4結 論

4.1漢密爾頓菌型棉蚜與沙雷氏菌型棉蚜其體內漢密爾頓菌屬與沙雷氏菌屬微生物豐度與對照組相比顯著升高，分別占比77.40%和12.04%。

4.2對照組與試驗組的優勢菌科均為腸桿菌科，但相對豐度有所差異，分別占96.14%、81.285%和84.22%。

4.3在門水平上，對照組與試驗組的優勢菌門均為變形菌門，對照組中優勢菌門相對物種豐富度占97.42%，試驗組沙雷氏菌型、漢密爾頓菌型棉蚜種群中的優勢菌門相對物種豐度占比分別為95.55%和92.78%。

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Analyze the microbial diversity of cotton aphids with different bacterial types in cotton fields

AN Zhe1，2， NIU Ruichang2， ZHU Xiangzhen2， WANG Li 2， ZHANG Kaixin2， LI Dongyang2， JI Jichao2， NIU Lin2， GAO Xueke2， LUO Junyu2， CUI Jinjie2， MA Deying1

（1. Key Laboratory of Monitoring and Safety Prevention and Control of Agriculture and Forest Pests， College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China; 2. State Key Laboratory of Cotton Biology / Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Anyang Henan 455000， China）

Abstract：【Objective】 To explore the differences of microbial species and abundance in different types of Aphis gossypii Glove.

【Methods】 "The V3-V4 region of 16SrRNA gene of symbiotic bacteria in different types of A. gossypii in cotton fields was sequenced by HiSeq platform， and the species and diversity of symbiotic bacteria in green bug bugs were analyzed.

【Results】 The dominant phylum of A. gossypii in the control group， serratia and Hamiltonella A. gossypii was Proteus， and the relative species abundance accounted for 97.42%， 95.55% and 92.78%， respectively. The dominant bacteria in the control group and the experimental group were Enterobacteriaceae， but the relative abundance was different， accounting for 96.14%， 81.285% and 84.22%， respectively. Compared with the control group， the microbial abundance of Hamiltonella and Serratia increased significantly， accounting for 77.40% and 12.04%， respectively.

【Conclusion】 "The microbial abundance of A. gossypii containing Serratia and Hamiltonella in cotton field is significantly affected， and the relative abundance of Hamiltonella and Serratia increased significantly.

Key words：16S rRNA; Aphis gossypii Glove; symbiotic bacteria; Hamiltonella spp.; Serratia spp.

Fund projects：The Science and Technology Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences （ZB2021046）

Correspondence author：MA Deying（1968-）， female， from Urumqi，Xinjiang， "professor， doctoral supervisor， research direction： green prevention and control of pests， （E-mail）mdynd@163.com

CUI Jinjie（1968-）， male，researcher， doctoral supervisor， research direction： Agricultural insects and Pest Control， （E-mail）Cuijinjie@126.com

收稿日期（Received）：2024-02-20

基金項目：中國農業科學院科技創新工程（ZB2021046）

作者簡介：安哲（1996-），女，內蒙古烏蘭察布人，碩士研究生，研究方向為農業昆蟲與害蟲防治，（E-mail）anzhe1206@126.com

通訊作者：馬德英（1968-），女，新疆烏魯木齊人，教授，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為有害生物綠色防控，（E-mal）mdynd@163.com

崔金杰（1968-），男，研究員，碩士生/博士生導師，研究方向為農業昆蟲與害蟲防治，（E-mail）Cuijinjie@126.com