當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠的抗疲勞作用研究

摘要：為研究當(dāng)歸多糖（Angelica polysaccharide，APS）對(duì)小鼠的抗疲勞作用，將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為游泳對(duì)照組、安靜對(duì)照組和當(dāng)歸多糖高劑量組（750 mg·kg?1）、中劑量組500（mg·kg?1）、低劑量組（250 mg·kg?1），藥物組給予28 d灌胃處理，對(duì)照組均給予等體積的生理鹽水處理，測(cè)定各組小鼠體重變化及小鼠游泳試驗(yàn)后血尿素氮、血乳酸、肝糖原、肌糖原、腦內(nèi)谷氨酸、腦內(nèi)γ-氨基丁酸的含量變化。結(jié)果表明：ASP對(duì)小鼠體重?zé)o顯著影響（P＞0.05）；各劑量組APS均能明顯延長(zhǎng)小鼠游泳的力竭時(shí)間（P＜0.05）；250～750 mg·kg?1劑量的ASP能減少小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸和尿素氮的累積（P＜0.01）；低劑量APS能顯著促進(jìn)小鼠力竭運(yùn)動(dòng)60 min后腦內(nèi)谷氨酸水平的升高和γ-氨基丁酸水平的下降（P＜0.05），且隨著APS劑量的增加，GLU/GABA比值增大；750 mg·kg?1劑量的APS對(duì)小鼠肝糖原的儲(chǔ)備量有顯著增強(qiáng)作用（P＜0.05）。綜上分析表明，一定劑量的當(dāng)歸多糖能有效降低小鼠中樞和外周疲勞。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸多糖；抗疲勞；尿素氮；血乳酸；糖原

中圖分類號(hào)：TS201.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253?2301（2024）10?0043?06

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.10.007

曹樹洪，官翔儀，朱曉皓，等.當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠的抗疲勞作用研究[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2024，55（10）：43?48.

Study on the Anti-fatigue Effect of Angelica Polysaccharide on Mice

CAO Shu-hong，GUAN Xiang-yi，ZHU Xiao-hao，ZHU Zhi-hao，TANG Bo，YANG Jun，XU Shi-jing*

（Bengbu College，Bengbu，Anhui 233000，China）

Abstract：In order to study the anti-fatigue effect of Angelica polysaccharide（APS）on mice，the experimental mice were randomly divided into the swimming control group，the sedentary control group，the high dosage group of polysaccharide（750 mg·kg?1），middle dosage group（500 mg·kg?1）and low dosage group（250 mg·kg?1）.The mice in the drug group were treated with intragastric administration for 28 days，and the mice in the control group were treated with the same volume of normal saline.Then，the changes of body weight and the contents of blood urea nitrogen，blood lactic acid，hepatic glycogen，muscle glycogen，glutamic acid andγ-aminobutyric acid in the brain of mice in each group were measured after the swimming test.The results showed that ASP had no significant effect on the body weight of mice（P＞0.05）.APS in each dosage group could significantly prolong the exhaustive swimming time of mice（P＜0.05）.ASP at the dosage of 250?750 mg·kg?1 reduced the accumulation of blood lactic acid and urea nitrogen in mice after exercise（P＜0.01）.The low dosage of APS could significantly promote the increase of glutamic acid level and the decrease ofγ-aminobutyric acid level in the hindbrain of mice after the exhaustive exercise for 60 min（P＜0.05），and the ratio of GLU to GABA increased with the increase of APS dosage.APS at the dosage of 750 mg·kg?1 significantly enhanced the storage of hepatic glycogen in mice（P＜0.05）.In conclusion，the analysis showed that a certain dose of angelica polysaccharide could effectively reduce the central and peripheral fatigue in mice.

Key words：Angelica polysaccharide；Anti-fatigue；Urea nitrogen；Blood lactic acid；Glycogen

疲勞是指運(yùn)動(dòng)能力和機(jī)體功能暫時(shí)下降的一種狀態(tài)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明機(jī)體長(zhǎng)期處于疲勞狀態(tài)將引發(fā)一系列生理問題和疾病。因此，抗疲勞相關(guān)的研究倍受關(guān)注，其主要聚焦于通過營(yíng)養(yǎng)干預(yù)緩解疲勞，其中天然多糖組分具有良好的抗疲勞、抗氧化作用，可幫助機(jī)體迅速恢復(fù)疲勞狀態(tài)下糖類的損耗。

大量研究表明，不同來源的多糖組分可能通過改變糖類和蛋白質(zhì)代謝[1]、調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的攜氧能力[2]、改善血清乳酸[3]、肌酸激酶[4]、腦內(nèi)L-谷氨酸（Glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（Aminobutyric Acid，GABA）[5]等生化指標(biāo)，減少氧化應(yīng)激，提高抗氧化損傷的能力[6]，進(jìn)而達(dá)到抗疲勞的效果。當(dāng)歸作為一種生物活性廣泛的傘形科植物，造血活血、抗炎、抗衰老、抗氧化、保肝護(hù)腎的功效成為中醫(yī)領(lǐng)域的共識(shí)，其主要活性成分為多糖，但其是否具有抗疲勞效果，目前尚未證實(shí)。當(dāng)歸多糖（Angelica polysaccharide，APS）組分復(fù)雜，包含中性多糖、弱酸性多糖和果膠多糖，結(jié)構(gòu)可以分為α和β兩種類型。其中，α型結(jié)構(gòu)是一種線性結(jié)構(gòu)，由D-葡萄糖和L-阿拉伯糖交替排列而成，每個(gè)單糖分子之間通過1-4鍵連接。而β型結(jié)構(gòu)則是一種支鏈結(jié)構(gòu)，由D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和D-半乳糖等單糖分子組成，其中的支鏈?zhǔn)怯蒁-半乳糖分子連接而成的[7]。周濤[8]對(duì)當(dāng)歸多糖可能存在的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示多種結(jié)構(gòu)的APS具有良好的體外抗氧化活性，且能對(duì)氧化損傷的Hep G2細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。但總體來講，其體內(nèi)抗疲勞的作用機(jī)制尚不十分清晰。本試驗(yàn)研究飼養(yǎng)小鼠28 d且連續(xù)口服當(dāng)歸粗多糖，在力竭運(yùn)動(dòng)過程中，小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力、血乳酸、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、肝糖原、肌糖原、腦內(nèi)谷氨酸、腦內(nèi)γ-氨基丁酸等指標(biāo)的變化，評(píng)價(jià)APS抗疲勞作用及可能的作用機(jī)制，為APS在保健食品領(lǐng)域進(jìn)一步的開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

SPF級(jí)KM系小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（25±2）g，試驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.410000000000004008；當(dāng)歸多糖，純度60%，購自陜西云奇生物科技有限公司，甘肅省岷縣當(dāng)歸材料；γ-氨基丁酸，浙江一諾生物科技有限公司，CAS：56-12-2）；L-（+）-乳酸標(biāo)品，酷爾生物，CAS：79-33-4）；健康盤片，批號(hào)：21953-15.9-0146-0227-55-200958-6665等）；L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，CAS：56-86-0；0.1%乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，ZCB012021，廣州檢測(cè)科技有限公司；乙腈，色譜級(jí)；三氯乙酸、高氯酸、濃硫酸、蒽酮、無水乙醇，均分析純，由國(guó)藥滬試提供。

1.2儀器設(shè)備

752紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；BS224S型電子天平，塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，淄博博納科技有限公司；LC-LCE05D高速冷凍離心機(jī)，上海力辰儀器科技有限公司；FL9510氣相色譜工作站，浙江福立分析儀器股份有限公司；SMT-120Pro全自動(dòng)生化分析儀，天津微納芯科技有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組及給藥方式將試驗(yàn)小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為5組，即當(dāng)歸多糖高劑量組（750 mg·kg?1）、中劑量組（550 mg·kg?1）、低劑量組（250 mg·kg?1）、游泳對(duì)照組和安靜對(duì)照組（對(duì)照組均為生理鹽水處理），每組20只，固定時(shí)間、等劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃28 d。

1.3.2不同劑量組小鼠體重的變化在小鼠的飼養(yǎng)管理周期，每7 d稱量1次各組小鼠體重，高、中、低劑量組小鼠體重變化與對(duì)照組分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異性分析，探索多糖灌胃劑量與小鼠體重變化之間的相關(guān)性。

1.3.3小鼠耐力的測(cè)定灌胃周期末次給藥30 min后，進(jìn)行力竭游泳試驗(yàn)和負(fù)重游泳。將小鼠置于28～30℃、水深30～40 cm的自制水槽中自由游泳，記錄小鼠自游泳開始至沉沒10 s仍不能浮出水面的時(shí)間，作為小鼠的力竭游泳時(shí)間[9]。負(fù)重游泳則是每只小鼠按小鼠體質(zhì)量4%在其尾根部綁扎鉛絲，記錄自游泳開始至沉沒10 s仍不能浮出水面的時(shí)間[10]。高、中、低劑量組小鼠力竭游泳時(shí)間、負(fù)重游泳時(shí)間分別與游泳對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異性分析。

1.3.4小鼠血乳酸含量測(cè)定小鼠力竭游泳90 min后，眼內(nèi)眥靜脈叢采血不低于2 mL，置于5 mL肝素鈉抗凝Ep管中，8 000 r·min?1低溫離心10 min，取上層血清20μL，加入10%三氯乙酸1.5 mL，調(diào)節(jié)pH 3～4，震蕩混勻，3 000 r·min?1離心10 min，取上清液100μL，加入乙腈400μL及5μL 20%高碘酸，迅速混合均勻，制備為色譜待測(cè)液[11]。

乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取1 g乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶于乙腈，定容至100 mL容量瓶，制成濃度為10 g·L?1儲(chǔ)備液，稀釋為1、2、3、4、5 mg·mL?1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。該標(biāo)準(zhǔn)溶液同條件高碘酸處理后進(jìn)行色譜分析。

乳酸色譜條件：KB-5色譜柱，0.32 mm，進(jìn)樣溫度220℃，柱溫40℃，分流比30∶1，尾吹30 mL·min?1，程序升溫保持時(shí)間5 min，F(xiàn)ID 200℃檢測(cè)，進(jìn)樣1μL。

1.3.5小鼠腦GLU、GABA含量測(cè)定待測(cè)液的制備：藥物組和游泳對(duì)照組的小鼠力竭游泳60 min，1 min內(nèi)斷頭取整腦組織，稱取1 g，加蒸餾水0.5 mL，勻漿，振搖1 min，再加蒸餾水3 mL，繼續(xù)振搖1 min，在9 000 r·min?1、4℃的條件下離心10 min，取上清液0.22μm濾膜過濾作為待測(cè)溶液[12]。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取1 gγ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，制成濃度為10 g·L?1儲(chǔ)備液，稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL?1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取1 g L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，制成濃度為10 g·L?1儲(chǔ)備液，稀釋為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL?1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

色譜條件：γ-氨基丁酸檢測(cè)時(shí)柱溫60℃，L-谷氨酸柱溫40℃，其他色譜條件相同，均為CD-WAX色譜柱，0.32 mm，進(jìn)樣溫度220℃，分流比30∶1，尾吹30 mL·min?1，程序升溫保持時(shí)間5 min，F(xiàn)ID檢測(cè)器，檢測(cè)溫度200℃，進(jìn)樣1μL。

1.3.6小鼠肝糖原、肌糖原測(cè)定小鼠力竭游泳60 min，立即處死小鼠，分別取肝臟200 mg、大腿肌肉組織1 g，碾碎，用0.9%生理鹽水沖洗，吸干水分，放入3 mL 30%氫氧化鉀溶液中，置沸水浴煮20 min，取出冷卻后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水多次沖洗，一并轉(zhuǎn)入容量瓶，加水定容到刻度，搖勻。置沸水浴中10 min，冷卻后用硫酸蒽酮比色法測(cè)定糖含量[13]。

1.3.7血尿素氮含量的測(cè)定小鼠力竭游泳90 min，休息60 min后采血，8 000 r·min?1離心10 min，分離出血清[14]，立即采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿素氮含量。方法：健康盤片，進(jìn)樣100μL，具體操作見設(shè)備說明書。

上述色譜過程采用外標(biāo)法分析，峰高與質(zhì)量濃度線性回歸，用GraphPad Prison 5統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用成組方差檢驗(yàn)的方法。

2結(jié)果與分析

2.1 APS對(duì)小鼠體重變化的影響

由表1可知，連續(xù)灌胃28 d后，各組小鼠體重沒有顯著差異，表明250～750 mg·kg?1的APS對(duì)小鼠體重沒有明顯影響。此外，在給予受試物期間，小鼠沒有不良反應(yīng)，活動(dòng)正常，沒有出現(xiàn)異常死亡，表明當(dāng)歸多糖在250～750 mg·kg?1劑量范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有毒副作用。

2.2 APS對(duì)小鼠耐力的影響

由表2可知，與安靜對(duì)照組相比，低劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和力竭游泳時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），中、高劑量組負(fù)重游泳時(shí)間和力竭游泳時(shí)間則極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）。表明給予250 mg·kg?1以上劑量的APS可以明顯延長(zhǎng)小鼠力竭時(shí)間，提高運(yùn)動(dòng)耐力。

2.3 APS對(duì)腦GLU、GABA含量的影響

由表3可知，游泳對(duì)照組小鼠腦內(nèi)GLU含量、GABA含量和GLU/GABA比值均極顯著高于安靜對(duì)照組（P＜0.01）。這表明在經(jīng)歷疲勞運(yùn)動(dòng)60 min后，小鼠腦內(nèi)的興奮性神經(jīng)地質(zhì)GLU和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA均增高。藥物組小鼠腦內(nèi)GLU含量高于游泳對(duì)照組，且低劑量組達(dá)顯著水平（P＜0.05），中、高劑量組達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），表明給與250 mg·kg?1以上劑量的APS有助于提高小鼠力竭運(yùn)動(dòng)開始后的60 min內(nèi)腦GLU水平，在一定程度上維持了小鼠的興奮性，且劑量越高，GLU水平也越高，表明作用越強(qiáng)。

低劑量組小鼠GABA含量顯著低于游泳對(duì)照組（P＜0.05），中、高劑量組GABA含量則極顯著低于游泳對(duì)照組（P＜0.01），表明250～750 mg·kg?1的APS均有助于促進(jìn)小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)后腦內(nèi)GABA水平的下降。劉雅娜等[15]在沙棘多糖對(duì)小鼠的抗疲勞作用研究中顯示，GLU/GABA比值更能反應(yīng)小鼠中樞的興奮性，認(rèn)為兩者比值越高，抗疲勞能力越強(qiáng)。在本試驗(yàn)中，250～750 mg·kg?1劑量的APS能明顯升高GLU/GABA比值，說明APS具有改善腦機(jī)能，推遲疲勞發(fā)生的作用。

2.4 APS對(duì)血乳酸、尿素氮及糖原的影響

由表4可知，游泳對(duì)照組小鼠乳酸含量極顯著高于安靜對(duì)照組，表明在疲勞運(yùn)動(dòng)過程中，血液中存在明顯的乳酸堆積。250 mg·kg?1劑量組的小鼠乳酸顯著低于游泳對(duì)照組（P＜0.05），500、750 mg·kg?1劑量組則極顯著低于游泳對(duì)照組（P＜0.01），表明在上述劑量范圍內(nèi)，APS有助于抑制血液中乳酸的堆積。乳酸是運(yùn)動(dòng)和保持體溫而消耗熱量的過程中產(chǎn)生的廢棄物，超出正常值的范圍，機(jī)體會(huì)有沉重、酸痛、疲勞的感覺。綜上分析可知，APS能有效減少劇烈運(yùn)動(dòng)過程中血乳酸的生成。

采用生化自動(dòng)分析儀測(cè)定血尿素氮含量，其醫(yī)學(xué)參考范圍為4.9～10.4 mmol·L?1。由表4可知，與安靜對(duì)照組比，游泳對(duì)照組小鼠血中BUN水平極顯著升高（P＜0.01），且超出了健康小鼠的最大范圍。表明小鼠在疲勞運(yùn)動(dòng)過程中，血液中的尿素氮水平持續(xù)升高，這可能與機(jī)體蛋白質(zhì)的分解代謝加強(qiáng)有關(guān)。但是，給藥組小鼠尿素氮水平均能維持在正常范圍內(nèi)，這表明持續(xù)給予超過250 mg·kg?1劑量的ASP能有效促進(jìn)小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞后BUN的清除，較快地降低至正常水平。

由表4可知，游泳對(duì)照組與安靜對(duì)照組相比，肝糖原和肌糖原的水平均極顯著降低（P<0.01）；不同劑量組與游泳對(duì)照組相比，APS對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后肌糖原的變化沒有觀察到顯著影響，但是對(duì)于肝糖原而言，中、低劑量無影響，高劑量組糖原水平則顯著高于游泳對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，高劑量的APS有助于緩解小鼠運(yùn)動(dòng)過程中肝糖原水平的下降，對(duì)肌糖原的變化影響不明顯。

3討論與結(jié)論

外周運(yùn)動(dòng)疲勞的主要表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物積累引起肌肉張力和運(yùn)動(dòng)耐力下降，血尿素氮和血乳酸含量越高，表明蛋白質(zhì)分解代謝增加，機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，發(fā)生了糖的無氧酵解，生成大量的乳酸，引發(fā)疲勞和炎性因子的釋放，自由基氧化損傷加重。中樞的疲勞則是大腦的興奮性活動(dòng)下降，可觀察到腦內(nèi)興奮性氨基酸含量水平較低，抑制性氨基酸含量則增高，其中最具有代表性的興奮性GLU和抑制性GABA的比值被認(rèn)為在一定程度上可以反映機(jī)體的疲勞狀態(tài)，比值越高，抗疲勞能力越強(qiáng)[16]。

本研究結(jié)果表明，連續(xù)服用不同劑量的APS對(duì)小鼠體重沒有明顯影響，但能有效降低小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)后血乳酸和血尿素氮的積累，促進(jìn)腦內(nèi)GLU的升高和GABA的下降，提高兩者比值。APS通過提高肝糖原的儲(chǔ)備量，增加小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，且具有潛在的量效關(guān)系。給予250 mg·kg?1的劑量有助于減少血乳酸和尿素氮的堆積并提高耐力，有助于抑制疲勞過程中的腦內(nèi)GLU的下降和GABA的上升，進(jìn)而維持大腦的興奮性；750 mg·kg?1劑量的APS能提高肝糖原的儲(chǔ)備量，延遲疲勞的發(fā)生，連續(xù)服用28 d效果最佳。

雖然許多研究表明，APS可能是通過提高機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力、延遲疲勞的發(fā)生或者加速疲勞的消除等方面來發(fā)揮生物學(xué)活性，但是其作用機(jī)制可能并不僅限如此。武錚等[17]認(rèn)為APS能通過抑制小鼠SA B Gal基因的表達(dá)，安方玉等[18]則認(rèn)為APS能增強(qiáng)抗氧化損傷酶活性，這兩種途徑均能減少自由基的生成，提高衰老小鼠的抗氧化能力。阮治寰等[19]研究發(fā)現(xiàn)APS提取物能減少血乳酸的堆積，其作用機(jī)制是APS在正常范圍內(nèi)增加紅細(xì)胞數(shù)量，減少IL-6的生成，進(jìn)而減少炎性因子引發(fā)的細(xì)胞死亡；APS能提高血紅蛋白Hb含量，且呈劑量依賴性增高，同時(shí)還能增強(qiáng)骨骼肌Hb的攜氧能力和運(yùn)輸能力，提高機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)缺氧的抵抗力。但是劉芳等[20]在海帶多糖對(duì)小鼠的抗疲勞研究結(jié)果中顯示，多糖能顯著提高Hb含量，但其作用并不隨劑量增加而加強(qiáng)。

本研究中測(cè)定的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，在力竭運(yùn)動(dòng)的時(shí)間上有固定性。實(shí)際上，在運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生的不同時(shí)間階段，隨著耗氧狀態(tài)的改變，機(jī)體的自我調(diào)節(jié)功能會(huì)發(fā)生變化，上述生化指標(biāo)也會(huì)有較大波動(dòng)。當(dāng)歸藥理學(xué)活性雖然多，但在本試驗(yàn)中未觀察到當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠帶來健康危害，表明APS應(yīng)用到抗疲勞食品開發(fā)領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此外，上述各項(xiàng)生化指標(biāo)之間的相關(guān)性以及當(dāng)歸多糖各組分的功能，尚值得進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）