基于16S rDNA序列的秋茄內生細菌多樣性分析

摘要：分析閩江河口濕地秋茄根、枝和葉中可培養內生細菌的多樣性，為秋茄內生細菌群落結構、分布、穩定性以及功能內生細菌的研究提供支撐。從秋茄Kandelia candel不同組織中分離可培養內生細菌，基于16S rDNA基因序列比對和系統發育分析內生細菌多樣性。結果表明，從秋茄3個組織中分離出36株可培養內生細菌，分屬于11屬22種（其中2株未被正式命名），其中芽孢桿菌屬Bacillus和弧菌屬Vibrio為優勢菌屬，分別占總株數的21.2%和19.4%。不同組織中內生細菌的分布和多樣性存在差異，根中內生細菌數量最多（27株，占總株數的75%），枝次之（6株，占總株數的16.7%），葉最少（3株，占總株數的8.3%）。秋茄內生細菌具有豐富的物種多樣性，不同組織之間呈現出差異性，根中內生細菌多樣性為最豐富。

關鍵詞：秋茄；內生細菌；分離；多樣性

中圖分類號：S345.661文獻標志碼：A文章編號：0253?2301（2024）10?0001?08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.10.001

陳維峰，林文波，郭萍萍，等.基于16S rDNA序列的秋茄內生細菌多樣性分析[J].福建農業科技，2024，55（10）：01?08.

優秀學者論壇

袁宗勝，1976年生，農學博士，生物學博士后，閩江學院地理與海洋學院副教授，高級工程師，碩士生導師。主要從事微生物資源開發利用與生態環境保護研究，系統開展海岸帶特殊生境微生物組與植物互作的基礎研究，強化基礎研究與生產實踐結合，重點開展功能微生物資源在農林產業和生態環境治理上的應用研究。先后主持省市科技計劃項目10余項，發表論文50余篇，出版專著1部，主持制修訂地方標準5項，以第一發明人獲授權國家發明專利20件。兼任福建省竹產業標準化技術委員會委員，福建省土壤與肥料標準化技術委員會委員，福州市林學會常務理事。

Diversity Analysis of Endophytic Bacteria in Kandelia candel Based on 16S rDNA Sequence

CHEN Wei-feng1，2，LIN Wen-bo3，GUO Ping-ping3，ZHANG Chun4，WANG Si-fan5，LIU Fang2，YUAN Zong-sheng1*

（1.College of Geography and Oceanography，Minjiang University，Fuzhou，Fujian 350108，China;2.College of LifeSciences，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;3.Fujian Minjiang Estuary WetlandNational Nature Reserve Management Office，Fuzhou，Fujian 350200，China;4.Zhangzhou Forestry Science andTechnology Promotion Station，Zhangzhou，Fujian 363000，China;5.College of Future Technology，Fujian Agricultureand Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China）

Abstract：The diversity of culturable endophytic bacteria in the roots，branches and leaves of Kandelia candel in the wetland of Minjiang River estuary was analyzed，in order to provide support for the study of endophytic bacteria community structure，distribution，stability and functional endophytic bacteria in Kandelia candel.In this study，the culturable endophytic bacteria were isolated from different tissues of Kandelia candel，and the diversity of endophytic bacterial was analyzed based on 16S rDNA gene sequence alignment and phylogeny.The results showed that 36 strains of culturable endophytic bacteria were isolated from three tissues of Kandelia candel，belonging to 11 genera and 22 species（2 strains among which were not officially named）.Bacillus and Vibrio were the dominant genera，accounting for 21.2%and 19.4%of the total strains，respectively.There were differences in the distribution and diversity of endophytic bacteria in different tissues，among which the number of endophytic bacteria was the highest in roots（27 strains，accounting for 75%of the total number of strains），followed by branches（6 strains，accounting for 16.7%of the total number of strains），and the least in leaves（3 strains，accounting for 8.3%of the total number of strains）.The endophytic bacteria in Kandelia candel had rich species diversity in the wetland of Minjiang River estuary，and there were differences among different tissues.The diversity of endophytic bacteria in the roots was the most abundant.

Key words：Kandelia candel；Endophytic bacteria；Isolation；Diversity

河口濕地是位于河流與海洋交匯處的特殊生態系統，具有豐富的生物多樣性和重要的生態服務功能，在沉積物的積累、水質凈化、生物多樣性保護以及為人類提供資源方面發揮著重要作用[1?3]。河口濕地的植被類型多樣，例如在閩江河口濕地植被類型包括秋茄、蘆葦、短葉茳芏等[4?5]，這些植物不僅適應了高鹽度、潮汐波動和泥沙沉積的環境，形成了特殊的河口濕地植被群落為當地的野生動物提供棲息地，還有助于固土護岸，防止侵蝕。河口濕地的生態環境受到多種因素的影響，包括潮汐、沉積物類型、鹽度、水文條件和人類活動等[6?7]。

秋茄Kandelia candel隸屬于紅樹科Rhizo-phoraceae秋茄樹屬Kandelia，在中國主要分布在海南、廣東、廣西、臺灣、福建、浙江等地。秋茄喜光，耐鹽堿，多生長在河口濕地，是改造海涂、海灘組成紅樹林的主要樹種之一。秋茄根際土壤環境復雜多變，漲潮落潮反復交替，其內生細菌群落更為豐富多樣。內生菌在宿主植物的生長階段中扮演了重要角色，它們與宿主植物之間形成了互惠互利的關系，對于植物的生長發育、抗逆性以及次生代謝產物的合成等方面都有著積極的影響[8?10]。此外，內生菌在環境修復領域具有廣泛的應用前景，尤其是在重金屬和有機污染物的修復方面展現出巨大的潛力[11?13]。例如，Yang等[14]從鎘的超富集植物龍葵中分離了內生菌DE5，并且其研究表明接種了DE5的青葙根部生物量和Cd的富集能力得到顯著提升。

研究表明秋茄內生細菌具有耐鹽特性，可以在高鹽環境中生存并促進秋茄的生長，這些耐鹽內生細菌包括越南芽孢桿菌Bacillus vietnamensis、阿氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai等，它們在改良和利用鹽堿地方面具有潛在的應用價值[15]。秋茄內生細菌還表現出對對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌和銅綠假單胞菌等具有抑制作用[16?18]，表明秋茄內生細菌可能作為新的抗菌源被開發，其在提高植物耐鹽性、促進植物生長以及作為天然抗菌劑方面具有重要的應用潛力。因此，本研究通過分離、培養秋茄不同組織中可培養內生細菌，探究秋茄內生細菌群落結構與分布，為后續功能菌株的挖掘與開發利用奠定基礎。

1材料與方法

1.de89f1ae96997183366a8d031a2d17b41試驗區概況

試驗區位于福建省福州市長樂區閩江河口濕地，是中國東南沿海典型的濱海濕地生態系統，閩江河口濕地年平均溫度為19.3℃，年平均降水量為1 382.3 mL，該地區的水文特征為規則的半日潮，主要水源包括潮汐、閩江和其他內陸河流。

1.2植物樣品的采集

選取長勢良好的健康秋茄植株，取20 cm左右深度的呼吸根，剔除土壤等雜質后作為根樣本；選取生長健康、無病斑的秋茄枝、葉樣本。采集后立即放入無菌樣品袋中，4℃保鮮，并于48h內分離內生細菌。

1.3分離培養基

NA培養基：蛋白胨5 g，Nacl 5 g，瓊脂18 g，牛肉膏3 g，水1 000 mL，pH7.0～7.2。

1.4可培養內生細菌的分離與純化

用無菌水沖洗秋茄根、枝、葉組織樣本，于凈工作臺中將無菌濾紙吸干后樣本按照不同組織分別稱量1 g，75%C2H5OH浸5 min，5%NaClO溶液浸3 min，無菌水漂洗3～5次，處理后將樣本用無菌濾紙吸干，置于NA平板表面3～5 min，取最后一次漂洗用的無菌水涂布于NA平板上，置于30℃恒溫培養箱培養。平板上無菌落長出則證明樣品表面消毒徹底，若有菌落生長，表明該分離結果無效。將樣本用無菌剪刀剪碎至無菌研缽中，加適量無菌水無菌石英砂充分研磨至勻漿，將原液稀釋至10?2、10?3、10?4、10?5梯度，取100μL稀釋液涂布于NA平板上，各樣品重復3次。

1.5內生細菌的16S rDNA鑒定

將分離到的內生細菌菌株轉接至NA培養基培養24 h后，使用細菌基因組提取試劑盒提取DNA，在對其進行16S rDNA基因序列擴增。

（1）反應體系：25μL反應液中包含10×PCR Buffer 2.5μL，基因組DNA 0.5μL，10 mmol dNTP 0.5μL，20μmol引物Pf 0.5μL，20μmol引物Pr 0.5μL，Taq酶（5 U·uL–1）0.5μL，ddH2O補足25μL，離子水為空白對照。

（2）PCR擴增條件：94℃預變性4 min，變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環35次；72℃延伸8 min。

用1%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。把獲得的測序列，登錄數據庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/比對及同源性分析，并構建系統發育樹。

2結果與分析

2.1秋茄內生細菌的分離與16S rDNA鑒定

由表1可知，從秋茄根、枝和葉中共分離獲得36株內生細菌，其中根部內生細菌最多，為27株；其次為枝（6株）；最少為葉（3株）。對所分離的36株紅樹內生菌株進行16S rDNA序列分析后，為了鑒別出對應的細菌種類，將所得到的DNA序列通過http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/網站中的Blast功能進行相似性比對，通過比對可知，僅有2株菌種相似性低于99%，其余34株菌種16S rDNA序列相似性都在99%以上。

根據BLAST比對結果（表1），將36株紅樹內生細菌初步歸屬為11屬22種（其中2株未被正式命名）。基于16S rRNA基因，分離的34株內生菌株分屬厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Pseudomonadota這2個菌門。屬于厚壁菌門Firmicutes的內生細菌有19株，占分離總株數的52.8%，包括阿氏芽孢桿菌Bacillus aryabhattai、芽孢桿菌Bacillus sp.、暹羅芽孢桿菌Bacillus siamensis、貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis、解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、副地衣芽孢桿菌Bacillus paralicheniformis、地衣芽孢桿菌Bacillus licheni-formis、阿氏普里斯特氏菌屬Priestia aryabhattai。其中芽孢桿菌屬Bacillus為厚壁菌門Firmicutes中的優勢屬，有17株，占分離總株數的47.2%。屬于變形菌門Pseudomonadota的內生菌株有15株，占分離總株數的41.7%，包括副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、太平洋別樣楊氏桿菌Alloyangia pacifica、楊氏桿菌Yangia pacifica、需鈉弧菌Vibrio natriegens、玫瑰色菌Roseibium sp.、棲鹽生植物根瘤菌Rhizobium halophytocola、弧菌Vibrio sp.。其中弧菌屬Vibrio為變形菌門Pseudomonadota中的優勢屬，共分離到7株，占分離總菌株數的19.4%。棲鹽生植物根瘤菌Rhizobium halophy-tocola、楊氏桿菌Yangia pacifica、硫膨大桿菌Thioclava sp.內生細菌分別有1株，各占分離總菌株數的2.7%。玫瑰色菌Roseibium sp.內生細菌有3株，占分離總菌株數的8.3%。太平洋別樣楊氏菌Alloyangia pacifica內生細菌有2株，占分離總菌株數的5.6%。

2.2秋茄不同組織內生細菌分布

從不同組織內生細菌分布（圖1）可知，秋茄根、枝、葉分別分離到27株、6株、3株，共36株內生細菌，根分離25株包括11屬18種（含2株未知菌屬），枝分離6株包括1屬1種，葉分離3株包括1屬1種。其中別樣楊氏桿菌屬Alloyangia、根瘤菌屬Rhizobium、楊氏桿菌屬Yangia、普里斯特氏菌屬Priestia、弧菌屬Vibrio、玫瑰菌屬Roseibium、新穎芽孢桿菌屬Neobacillus、硫膨大桿菌屬Thioclava僅在根部分離獲得，而枝和葉僅有芽孢桿菌屬Bacillus。從菌屬種類分布情況可以發現根部物種多樣性最豐富，其次是枝、葉。在秋茄根部分離的可培養內生細菌的數量中芽孢桿菌屬Bacillus和弧菌屬Vibrio占比最大，分別占根分離總數的29.6%和25.9%，而秋茄枝和葉分離的菌屬比較單一，均為芽孢桿菌屬Bacillus。

從秋茄不同組織內生細菌屬水平多樣性指數（表2）可知，根組織中的豐富度最高，有9種不同的內生細菌，而枝和葉的豐富度較低，分別只有1種。根組織的香農多樣性指數最高，為2.85，表明根中的內生細菌群落具有較高的多樣性和均勻度。相比之下，枝和葉的香農多樣性指數為0，說明這些組織中的內生細菌群落多樣性非常低。根組織的辛普森多樣性指數為0.83，而枝和葉的指數為0，表明根中的內生細菌群落多樣性較高。根組織的皮盧均勻度為0.9，接近1，表明根中的內生細菌群落中各物種分布相對均勻。枝和葉的皮盧均勻度為0，表明這些組織中的內生細菌群落中物種分布極不均勻。根組織的Chao1和ACE指數分別為16.5和20.93，遠高于枝和葉的1，這表明根組織中可能存在更多的未被培養的內生細菌物種。

2.3秋茄內生細菌的16S rDNA序列系統發育分析

將秋茄內生細菌的16S rDNA序列構建成系統發育樹（圖2），可知構建出的系統發育樹主要分為4個支系，其中一支系中包含了秋茄20株內生細菌，涵蓋了根、枝、葉組織的內生細菌，以芽孢桿菌屬Bacillus、弧菌屬Vibrio為主，其余的小部分菌株都在其他分支系中散落分布。圖2中的Bootstrap值顯示，許多分離出的內生細菌菌株具有密切的親緣關系，它們歸屬于相同的種屬。

3討論與結論

3.1秋茄內生細菌的群落組成

本研究從閩江河口濕地秋茄根、枝和葉組織分離到36株可培養內生細菌，分屬于11屬22種（含2株未知菌屬），其中芽孢桿菌屬Bacillus和弧菌屬Vibrio的數量最多，比較少見的有棲鹽生植物根瘤菌Rhizobium halophytocola、玫瑰色菌Roseibium sp.、阿氏普里斯特氏菌Priestia aryab-hattai、太平洋別樣楊氏菌Alloyangia pacifica、暹羅芽孢桿菌Bacillus siamensis、貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis、需鈉弧菌Vibrio natriegens、人參土新穎芽孢桿菌Neobacillusginsengisoli、硫膨大桿菌Thioclava sp.，表明秋茄內生細菌資源豐富且特殊。

棲鹽生植物根瘤菌Rhizobium halophytocola、玫瑰色菌Roseibium sp.、阿氏普里斯特氏菌Priestia aryabhattai是近海與極地海洋植物中特有的內生細菌，其中棲鹽生植物根瘤菌Rhizobium halophytocola能夠在高鹽環境中生存，并且與植物形成共生關系，幫助植物在鹽漬土中吸收水分和養分[19]。而喜鹽類細菌如暹羅芽孢桿菌Bacillus siamensis的耐鹽性和益生能力而備受關注，Brahim等[20]對暹羅芽孢桿菌BW菌株耐鹽性研究結果表明，BW菌株能夠在3M NaCl中生長，表現出耐鹽性，并且通過生物誘導種子處理，能夠顯著減輕水稻幼苗的鹽脅迫。玫瑰色菌屬Roseibium具有多樣化的生理代謝功能如好氧不產氧光合作用、一氧化碳氧化、硫化物降解等[21]。在余小蘭等[22]的研究中證明了阿氏普里斯特氏菌Priestia aryabhattai能夠提高黑葉白菜產量的同時，能通過降低硝酸鹽含量，提高游離氨基酸、維生素C和可溶性糖等途徑改善其品質。而硫膨大桿菌Thioclava sp.、太平洋別樣楊氏菌Alloyangia pacifica相關研究鮮有報道，其具體的生理功能作用有待進一步發掘。秋茄生長環境復雜，探究特殊環境的植物內生細菌有助于我們更好地理解這些細菌的生物學特性，對于預防和控制相關疾病生物防治以及生物改良有重要意義。

3.2秋茄不同組織內生細菌分布和多樣性

由秋茄不同組織內生細菌屬水平上分布圖可以發現，秋茄根部可培養內生細菌多樣性顯著高于秋茄的枝和葉，這與大多數的植物內生細菌生態位分布表現一致[23?26]。隨著秋茄生態位置的改變，其不同組織內生細菌也發生改變，推測可能是由于不同組織的生長環境不同引起的變化，秋茄根際環境長期處于漲潮落潮反復交替的泥質海灘，根際環境相對于枝和葉則更為復雜，微生物多樣性較為豐富。而枝葉可能在漲潮的時間段內會被浸泡在海水中，這種周期性的水淹為微生物提供了獨特的生存環境，從而影響了微生物多樣性，特別是從秋茄枝分離出的且也是枝特有的暹羅芽孢桿菌Bacillus siamensis可以證明這一點。秋茄葉片的微生物多樣性比較單一，只有芽孢桿菌屬Bacillus一種，這可能是由于葉片的環境比較簡單受海水以及潮水的影響較小。

秋茄內生細菌的多樣性可能與其生長環境的鹽度、溫度和季節變化密切相關。這些內生細菌通過產生不同的代謝產物來適應環境壓力，對于秋茄的生長和健康發揮著重要作用。通過研究這些特殊環境植物的內生細菌，有助于更好的挖掘其潛在的應用價值。

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（責任編輯：柯文輝）