黑龍江省高致病性禽流感、新城疫免疫抗體集中監(jiān)測情況與分析

摘 要：為評估高致病性禽流感疫苗和新城疫疫苗的免疫效果，以期對我省禽病防控政策制定提供數(shù)據(jù)支持，試驗采用血凝試驗和血凝抑制試驗對黑龍江省13個地市采集的7 793份家禽血清樣品分別檢測H5亞型、H7亞型高致病性禽流感抗體水平，并對其中2 547份家禽血清進行了新城疫抗體檢測。結(jié)果顯示，2021—2023年H5亞型禽流感免疫抗體合格率依次為95.90%（Re-11株）、77.01%（H5-Re13株）和96.43%（H5-Re13株）；H7亞型禽流感免疫抗體合格率依次為94.37%（Re-3株）、77.96%（H7-Re4株）和96.60%（H7-Re4株），新城疫免疫抗體合格率依次為97.46%、83.66%和94.44%。13個地市免疫抗體監(jiān)測結(jié)果顯示，H5亞型禽流感免疫抗體合格率為82.88%～100.00%，H7亞型禽流感免疫抗體合格率為79.50%～99.01%，新城疫免疫抗體合格率為74.20%～100.00%；不同場點H5亞型禽流感免疫抗體合格率分別為規(guī)模場94.65%、散養(yǎng)戶89.33%，H7亞型禽流感免疫抗體合格率分別為規(guī)模場95.03%、散養(yǎng)戶87.74%，新城疫免疫抗體合格率分別為規(guī)模場96.13%、散養(yǎng)戶89.23%。各項免疫抗體合格率均高于國家規(guī)定的70%，由此說明我省高致病性禽流感疫苗和新城疫疫苗免疫效果良好。

關(guān)鍵詞：高致病性禽流感；新城疫；血清；免疫抗體；血凝抑制

中圖分類號：S852.4 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2024）12-0026-07

高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的以禽類為主的急性傳染病[1]，在禽類中傳播快、危害大、病死率高。目前，已知的高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）為H5亞型或H7亞型。禽感染HPAIV死亡率可達100%，導致重大經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病，同時HPAIV可以直接感染人并致人死亡，是重要的人獸共患病病原[2]。

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）強毒株感染禽類引起的一種急性、烈性傳染病，可感染200余種禽類[3-4]。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將新城疫列為必須報告的動物疫病，2022年我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為二類動物疫病。

疫苗免疫是防控HPAI和ND最直接、最有效的措施之一。為了評估HPAI和ND疫苗的免疫效果，構(gòu)筑有效免疫屏障，切實保障家禽健康與動物產(chǎn)品質(zhì)量。本研究對黑龍江省2021—2023年HPAI疫苗、ND疫苗的免疫抗體進行監(jiān)測和分析，以期為我省HPAI和ND科學防控提供數(shù)據(jù)支持。

1" 材料與方法

1.1" 樣品

采用配額抽樣方法[5]采集全省13個地市養(yǎng)殖場/戶的家禽血清或全血樣品。根據(jù)《黑龍江省動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃》，從每個地市的每個規(guī)模場隨機采集血清樣品不少于20份，每個散養(yǎng)戶隨機采集血清樣品不少于5份。

采集家禽全血樣品，將全血轉(zhuǎn)移至2 mL無菌離心管中，500 g/min離心10 min，小心吸取上清裝入1.5 mL離心管中，加蓋并做好標記，與血清樣品一起置-20 ℃冷凍保存、備用。

1.2" 主要試劑及儀器

主要試劑：禽流感病毒H5亞型（Re-11株）血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H5亞型（H5-Re13株）血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H7亞型（Re-3株）血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H7亞型（H7-Re4株）血凝抑制試驗抗原，均為哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，雞新城疫血凝抑制試驗抗原為哈爾濱國生生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

主要儀器：多道微量可調(diào)移液器（L-300 XLS型，RAININ公司）、離心機（miniSpin plus，艾本德公司）。

1.3" 檢測指標及方法

1.3.1" 禽流感免疫抗體檢測" 采用血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）檢測H5亞型、H7亞型HPAI疫苗的免疫抗體，具體步驟按照GB/T 18936-2020《高致病性禽流感診斷技術(shù)》進行。依據(jù)《國家動物疫病免疫技術(shù)指南》，HPAI疫苗免疫效果判斷標準：HI效價不低于24，判定為個體免疫合格；免疫合格個體數(shù)量占免疫群體總數(shù)不低于70%，判定為群體免疫合格。

1.3.2" ND免疫抗體檢測" 采用HA和HI方法檢測ND疫苗免疫抗體，具體步驟按照GB/T 16550-2020《新城疫診斷技術(shù)》進行。依據(jù)《國家動物疫病免疫技術(shù)指南》，ND疫苗免疫效果判斷標準：HI效價不低于25，判定為個體免疫合格；個體免疫抗體合格數(shù)量占免疫群體總數(shù)不低于70%的判定為群體合格。

1.4" 統(tǒng)計與分析

應(yīng)用Excel 2019和GraphPad Prism 8軟件對檢測數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計和分析。運用卡方檢驗分析試驗結(jié)果，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 樣品來源

2021—2023年春秋兩季集中強制免疫1個月后，采用配額抽樣方法[5]共采集13個地市61個縣（市/區(qū)）家禽樣品7 793份用于HPAI疫苗免疫抗體監(jiān)測，包括288個規(guī)模場的4 653份血清和363個散養(yǎng)戶的3 140份血清，樣品來源見表1。同時，對其中38個縣（市/區(qū)）2 547份家禽血清進行了ND疫苗免疫抗體監(jiān)測，包括78個規(guī)模場1 756份血清和117個散養(yǎng)戶791份血清，樣品來源見表2。

2.2" 不同年度免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

2021—2023年監(jiān)測結(jié)果見表3。HPAI疫苗免疫后抗體監(jiān)測結(jié)果表明，2023年H5亞型、H7亞型禽流感免疫抗體合格率最高，分別為96.43%和96.60%；2022年H5亞型、H7亞型禽流感免疫抗體合格率最低，分別為77.01%和77.96%。ND疫苗免疫抗體合格率：2021年最高，為97.46%；2022年最低，為83.66%。2021—2023年兩種疫苗免疫抗體合格率均高于國家規(guī)定70%標準。

2.3" 不同地市免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

將監(jiān)測結(jié)果按照樣品來源地不同進行匯總分析，具體結(jié)果見表4。全省13個地市H5亞型禽流感免疫抗體合格率為82.88%～100%。J、M兩個地市合格率最高，為100%；A地市最低，為82.88%。H7亞型禽流感免疫抗體合格率為79.50%～99.01%，J地市合格率最高，為99.01%；A地市最低，為79.50%。新城疫免疫抗體合格率為74.20%～100%，其中J、K兩個地市的合格率最高，為100%；I地市最低，為74.20%。

2.4" 不同場點免疫抗體監(jiān)測結(jié)果

不同場點免疫抗體監(jiān)測結(jié)果見表5。HPAI疫苗免疫抗體：2021—2023年共監(jiān)測全省13個地市288個規(guī)模場家禽血清樣品4 653份，363個散養(yǎng)戶家禽血清樣品3 140份。ND疫苗免疫抗體：共監(jiān)測全省13個地市78個規(guī)模場家禽血清樣品1 756份，117個散養(yǎng)戶家禽血清樣品791份。規(guī)模場各項免疫抗體合格率為94.65%～96.13%，散養(yǎng)戶各項免疫抗體總合格率為87.74%～89.33%，規(guī)模場的H5亞型、H7亞型禽流感和新城疫免疫抗體總合格率均極顯著高于散養(yǎng)戶的合格率（P＜0.01）。

3" 討論

試驗中HPAI疫苗免疫抗體監(jiān)測的血清樣品以雞血清為主，少部分為鴨、鵝血清。監(jiān)測結(jié)果表明，不同年度、不同場點、不同地市的H5亞型禽流感和H7亞型禽流感抗體總合格率均達到不低于70%的國家標準，表明我省家禽HPAI疫苗整體免疫效果良好。從不同年度的HPAI疫苗免疫抗體監(jiān)測結(jié)果看，2022年H5亞型和H7亞型禽流感免疫抗體總合格率明顯低于2021年、2023年的總合格率，原因可能與2022年國家調(diào)整了HPAI滅活疫苗種毒有關(guān)，H5亞型HPAI疫苗種毒由原來的代表株2.3.4.4b分支H5N1 Re-11株替換為代表株2.3.4.4h分支H5N6 H5-Re13株，H7亞型HPAI疫苗種毒由原來的H7N9 H7-Re3株替換為H7N9 H7Re4株。新疫苗株首免后并不是所有的家禽都能產(chǎn)生較高的抗體水平，群體越大，個體差異也越大；同時，只進行一次免疫接種的家禽，其抗體的滴度、整齊度和合格率可能都不理想。我省免疫抗體監(jiān)測是在春秋兩季集中強制免疫后一個月進行，大多數(shù)被檢禽群只免疫了一次，所以2022年家禽HPAI疫苗免疫抗體水平相對較低。不同地市的免疫抗體監(jiān)測結(jié)果顯示，A地市HPAI兩項免疫抗體合格率均為13個地市中最低，分析原因可能是A地市多在商品肉雞場采樣，因肉雞生長周期短，出欄前通常只進行一次HPAI疫苗免疫，故A地市免疫抗體合格率最低[6]。從不同場點來看，規(guī)模場HPAI疫苗與ND疫苗免疫抗體合格率極顯著高于散養(yǎng)戶合格率（P＜0.01），其原因可能是規(guī)模化養(yǎng)殖場相對于散養(yǎng)戶來說其免疫程序更加科學，飼養(yǎng)管理水平更高，疫苗的運輸儲存條件更加良好[7]，故規(guī)模場免疫效果更好。我省位于候鳥遷徙路線上，需做好家禽特別是水禽的疫苗免疫，重點防范野鳥源HPAI傳播風險。

試驗對來自13個地市38個縣（市/區(qū)）2 547份家禽血清檢測ND疫苗免疫抗體水平，其中2 400份血清達到ND個體免疫合格水平，免疫總合格率為94.23%。從不同年份來看，2022年ND免疫抗體合格率稍低，為83.66%，其他年度合格率均超過90%。從不同地市來看，I地市合格率最低為74.20%。從不同場點來看，規(guī)模場的合格率高于散養(yǎng)戶。我省ND整體免疫水平超過國家規(guī)定70%的標準，表明我省ND疫苗整體免疫效果較好。試驗中ND監(jiān)測樣品絕大多數(shù)來源于雞，較小部分血清樣品來源于鵝。目前我國家禽ND流行態(tài)勢較為平穩(wěn)，雞ND防控效果較好，鵝ND強毒株污染面逐漸擴大[8]。國家新城疫參考實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，近年來我國鴿群NDV檢出率呈明顯升高趨勢[9]，提示我省在后續(xù)ND監(jiān)測工作中可以增加除雞以外其他家禽采樣種類和數(shù)量，做好ND風險監(jiān)測及預(yù)警。

根據(jù)流行病學原理，群體中個體免疫合格率達到一定水平可以有效控制個體之間的傳播，疫病流行情況就會有效降低[10]。因此，疫苗接種后適時開展免疫效果監(jiān)測，評估群體抗體水平十分必要。目前，最常用于HPAIV和NDV抗體檢測的方法是HI試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗。HI試驗與病毒中和試驗有很好的相關(guān)性，常常通過檢測HI抗體效價來評估保護性免疫反應(yīng)[11]。我省在每年春季和秋季集中免疫工作開展后，集中監(jiān)測評價免疫效果，對于禽群抗體合格率未達到70%的養(yǎng)殖場/戶，及時組織開展疫苗補免工作，構(gòu)筑有效免疫屏障。

2004年以來，我國采用“撲殺+強制免疫”的防控策略，并于2005年以后對家禽實施HPAI疫苗強制免疫[12]，相關(guān)疫苗在我國家禽中大規(guī)模應(yīng)用后，有效控制了我國H5、H7亞型HPAI疫情，也阻斷了H7N9病毒對人的感染[13-14]。我國在上世紀80年代以來采取ND普遍免疫的防控策略[10]，ND的流行范圍和危害程度有所下降。疫苗的應(yīng)用使HPAI和ND在我國的流行整體呈下降趨勢[12，15]，兩種疫病防控取得了一定成效。但與此同時，疫苗應(yīng)用帶來的弊端也逐漸顯現(xiàn)，例如大規(guī)模疫苗接種導致禽流感病毒的變異加快、分支增多[16]，防控難度增大。實施綜合性防控已在家禽業(yè)達成共識，疫苗免疫結(jié)合加強飼養(yǎng)管理、提高生物安全水平、加大監(jiān)測力度、消除傳染源、降低病原擴散的風險等措施[16]，多措并舉才能有效降低或消除HPAI和ND對家禽產(chǎn)業(yè)和公共衛(wèi)生的危害[12]。

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Centralized Surveillance and Analysis of Immune Antibodies Against Highly Pathogenic Avian Influenza and Newcastle Disease in Heilongjiang Province

Abstract： In order to evaluate the immune efficacy of highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease vaccines and provide data support for the formulation of poultry disease prevention and control policies in our province， The experiment used the methods of hemagglutination and hemagglutination inhibition to test the immune antibodies against H5 subtype and H7 subtype of highly pathogenic avian influenza in 7 793 poultry serum samples collected from 13 cities in Heilongjiang Province respectively， and 2 547 poultry serum samples were tested for Newcastle disease antibodies. The results showed that the qualified rates of H5 subtype avian influenza immune antibodies from 2021 to 2023 were 95.90%（Re-11 strain）， 77.01%（Re-13 strain）， and 96.43%（Re-13 strain）， respectively; The qualified rates of H7 subtype avian influenza immune antibodies were 94.37%（Re-3 strain）， 77.96%（Re-4 strain）， and 96.60%（Re-4 strain）， respectively. The qualified rates of Newcastle disease immune antibodies were 97.46%， 83.66%， and 94.44%， respectively. The monitoring results of immune antibodies in 13 cities showed that the qualified rate of H5 subtype avian influenza immune antibodies was 82.88% to 100.00%， the qualified rate of H7 subtype avian influenza immune antibodies was 79.50% to 99.01%， and the qualified rate of Newcastle disease immune antibodies was 74.20% to 100.00%; The qualified rates of H5 subtype avian influenza immune antibodies at different sites were 94.65% for large-scale farms and 89.33% for free range households， The qualified rates of H7 subtype avian influenza immune antibodies at different sites were 95.03% for large-scale farms and 87.74% for free range households， The qualified rates of ND vaccine immune antibodies at different sites were 96.13% for large-scale farms and 89.23% for free range households. The qualification rate of various immune antibodies is higher than the national standard of 70%， indicating that the immunization work of highly pathogenic avian influenza and Newcastle disease vaccines in our province is effective.

Keywords： Highly pathogenic avian influenza; Newcastle disease; Serum; Immune antibodies; Hemagglutination inhibition