羅伊氏乳桿菌對輪狀病毒體內外復制的抑制作用及其對免疫因子表達的影響

［摘 要］ 目的：探討羅伊氏乳桿菌對輪狀病毒（RV）SA11株體內外復制的抑制作用，并闡明其對相關免疫因子表達的影響。方法：體外實驗，培養并鑒定羅伊氏乳桿菌，繪制羅伊氏乳桿菌標準曲線和生長曲線，篩選羅伊氏乳桿菌培養最佳時間和最適濃度。采用5×108、10×108、50×108、100×108、200×108和500×108 CFU·mL－1羅伊氏乳桿菌感染細胞，臺盼藍染色法檢測Caco-2 細胞存活率。將不同濃度羅伊氏乳桿菌與RV 體外共孵育并作用于Caco-2 細胞，Caco-2 細胞分為陰性對照組（NC 組）、陽性對照組（PC 組） 和107、108、109 及1010 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌組，免疫熒光灶法檢測羅伊氏乳桿菌作用后Caco-2 細胞中病毒滴度，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測不同濃度羅伊氏乳桿菌作用后Caco-2 細胞中RV VP6 基因拷貝數。體內實驗，將25 窩SPF 級乳鼠分為對照組、RV 組（感染SA11 毒株）、Ab-NC 組（抗生素處理耗竭腸道菌群）、Ab-RV 組（耗竭腸道菌群后感染SA11 毒株） 和Ab-Lac-RV 組（耗竭腸道菌群，并感染羅伊氏乳桿菌后感染SA11 毒株）。收取各組乳鼠灌胃第2、4、6、8 和10 天的糞便樣本和灌胃第4 天結腸組織樣本，RT-qPCR 法檢測各組乳鼠糞便中RV VP6 基因拷貝數和結腸組織中白細胞介素（IL）-1β、IL-8、IL-10、γ 干擾素（IFN-γ） 和腫瘤壞死因子（TNF）-αmRNA 表達水平。結果：羅伊氏乳桿菌生長良好，形態圓潤，呈圓形、光滑和乳白色的凸起樣菌落，且邊緣較整齊；革蘭染色后菌體呈紫色、不規則和方形桿狀；經16SrDNA 測序后序列同源性為99%，提示羅伊氏乳桿菌活化成功；羅伊氏乳桿菌活菌數與吸光度（A） 值呈線性關系，回歸分析標準曲線為Y=0.437 5X+0.000 6， R2=0.999 4。培養0～2 h，細菌處于對數生長期，細菌生長遲緩；培養2～14 h，細菌快速生長，并于培養14～16 h 時細菌生長趨于穩定，培養16 h 時達到細菌生長速率頂峰，隨后進入衰亡期。5×108、10×108、50×108、100×108和200×108 CFU·mL-1羅氏乳桿菌感染后，Caco-2 細胞存活率均gt;90%，因此選用上述濃度羅氏乳桿菌感染細胞。與PC 組比較，5×108、10×108、50×108、100×108和200×108 CFU·mL-1羅氏乳桿菌組Caco-2細胞中RV VP6基因拷貝數均明顯降低（ Plt;0. 01）。與PC 組比較，107、108、109和1010 CFU·mL－1羅伊氏乳桿菌組Caco-2 細胞中病毒滴度均明顯降低（Plt;0. 01）。與對照組比較，Ab-NC 組、Ab-RV 組和Ab-Lac-RV 組乳鼠腸道菌群菌落數量均明顯減少，乳鼠腸道菌群耗竭成功。灌胃第2和4天，與RV 組比較，Ab-RV 組乳鼠糞便中RV VP6 基因拷貝數明顯降低（Plt;0. 05）；灌胃第4、6、8 和10 天，與Ab-RV 組比較，Ab-Lac-RV 組乳鼠糞便中RV VP6 基因拷貝數明顯降低（Plt;0. 05）。與對照組比較，Ab-RV組和Ab-Lac-RV組乳鼠結腸組織中IL-1β、IL-10、IFN-γ及TNF-α mRNA表達水平均明顯升高（Plt;0. 05或Plt;0. 01），IL-8 mRNA 表達水平均明顯降低（Plt;0. 05），Ab-Lac-RV組乳鼠結腸組織中IL-10 mRNA表達水平明顯升高 （Plt;0. 01）。結論：羅伊氏乳桿菌可能通過上調IL-1β、IL-10、IFN-γ 和TNF-α mRNA 表達及下調IL-8 mRNA 表達，抑制RV 復制。

［關鍵詞］ 羅伊氏乳桿菌； 輪狀病毒； 乳鼠； 免疫因子； 標準曲線

［中圖分類號］ R373. 2 ［文獻標志碼］ A

羅伊氏乳桿菌可在人體不同部位定植，主要存在于消化系統，也可定植于泌尿系統、生殖系統和皮膚［1］。研究［2-9］ 顯示：羅伊氏乳桿菌可改善腸道功能和胃腸道癥狀， 恢復人類微生物群的平衡組成，在治療急性水樣腹瀉和預防新的腹瀉發作方面發揮積極作用。輪狀病毒（rotavirus，RV） 是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體之一。研究［10］ 表明：RV在腸道內的感染和定植可明顯減少腸道內乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌數量。目前，益生菌與口服補液等傳統治療藥物相結合，成為RV 誘導胃腸炎的治療干預手段。

本課題組［11］ 前期通過建立RV 感染乳鼠模型并分析RV 與細菌之間的關系，對乳鼠腸道內容物進行16S rRNA 測序分析，結果顯示：與未感染病毒組比較，病毒感染組羅伊氏乳桿菌相對豐度明顯降低。羅伊氏乳桿菌對RV 復制的影響及其分子機制尚不明確。本研究探討羅伊氏乳桿菌對RV 復制的影響，并闡明小鼠體內免疫因子變化情況，為腸道益生菌在RV 臨床治療中的應用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、細胞、病毒和菌株 25窩SPF級昆明乳鼠購自錦州醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK （遼） 2020-0001，實驗動物倫理學審批號：2021014。Caco-2 細胞和RV SA11株均由錦州醫科大學基礎醫學院病原生物學實驗室保藏。羅伊氏乳桿菌菌株ATCC 23272 購自廣東微生物菌種保藏中心。

1. 2 主要試劑和儀器 胎牛血清 （fetal bovineserum，FBS） 和DMEM 培養基均購自美國Giboco公司，MRS 肉湯、MRS 瓊脂、厭氧袋、厭氧包和厭氧指示劑均購自青島海博生物技術有限公司，臺盼藍溶液和TRIzol 試劑均購自北京Solarbio 公司，VP6 抗體購自美國ImmuboCruz 公司，TB Green?Premix Ex TaqTM （Tli RNaesH Plus） 試劑盒和PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒均購自日本TaKaRa 公司，1% 青-鏈霉素混合液雙抗購自北京索萊寶科技有限公司。恒溫CO2培養箱購自美國Nuaire 公司，PCR 儀購自美國Bio-Rad公司，熒光顯微鏡購自德國Leica 公司，倒置顯微鏡購自重慶奧特光學儀器有限公司，酶標儀和紫外分光光度計均購自美國Thermo 公司。

1. 3 細胞培養 采用含10% FBS和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM 培養基培養Caco-2 細胞，待細胞貼壁生長，置于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態表現和細胞密度，待細胞生長至90% 且生長狀況良好時即可進行傳代培養。

1. 4 繪制羅伊氏乳桿菌生長曲線和標準曲線 菌株凍干粉采用0. 1～0. 2 mL MRS 肉湯培養基溶解后，接種于MRS 瓊脂平板上，37 ℃溫箱中厭氧培養48 h 后，挑取單個菌落至10 mL MRS 肉湯培養基中，37 ℃厭氧培養一定的時間，并采用分光光度計檢測其在波長600 nm 處的吸光度（A）值。6 000 r·min－1離 心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS） 重懸后進行平板稀釋涂布，按照10 倍梯度稀釋（10－7～10－1）， 將各濃度菌液涂布于MRS 瓊脂平板， 至少涂布3 個平板， 所有平板37 ℃倒置厭氧培養48 h，計數平板菌落數量，并取相同濃度的3 個平板菌落數平均值為其活菌數。以時間為橫坐標，A 值和活菌數為縱坐標繪制羅伊氏乳桿菌生長曲線。選取10－7稀釋的菌液進行2 倍比稀釋涂布平板（2－8～2－1），計算其菌落數，同時測定其菌液對應的A 值，隨后以菌落數為橫坐標，A 值為縱坐標，繪制回歸分析標準曲線。根據標準曲線和A 值計算細菌濃度，篩選羅伊氏乳桿菌培養最佳時間和最適濃度。每毫升中總活菌數（CFU·mL－1） =同一稀釋度菌落平均數（CFU·mL－1） × 稀釋倍數。

1. 5 臺 盼 藍 染 色 法 檢 測 Caco-2 細 胞 存 活 率 Caco-2 細胞以每孔2×106 個的密度接種于6 孔細胞培養板，待細胞密度為80%～90% 后，采用5×108、10×108、50×108、100×108、200×108和500×108 CFU·mL－ 1 羅伊氏乳桿菌感染細胞， 培養1 h后棄去菌液，PBS 緩沖液洗滌5 次，每孔加入2 mL含0. 5 mg·L－1 豬胰酶的DMEM 培養液。培養12 h后， PBS 緩沖液洗滌3 次，胰酶消化，將單細胞懸液與臺盼藍9∶1 混合，均勻注入細胞計數板，將計數板放入細胞計數儀中， 記錄結果， 每個樣本重復測定3 次。細胞存活率=活細胞/總細胞數×100%。

1. 6 免疫熒光灶法檢測羅伊氏乳桿菌作用后Caco-2細胞中病毒滴度 Caco-2細胞以每孔5×104個的密度接種于24孔細胞培養板，待細胞長至80% 后，將Caco-2 細胞分為陰性對照組（NC 組， Caco-2細胞不進行任何處理）、陽性對照組（PC 組，Caco-2細胞未感染羅伊氏乳桿菌） 和107、108、109及1010 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌組［分別采用107、108、109 和1010 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌與Caco-2細胞共孵育 1 h 后， 每孔加入感染復數（multiplicity of infection， MOI） 為1 的RV， 感染細胞1 h， 棄去病毒液， PBS 緩沖液潤洗1 次， 每孔加入2 mL 含0. 5 mg·L－1 豬胰酶的DMEM 培養液］。各組細胞維持培養12 h 后進行免疫熒光實驗：吸棄維持液，PBS 緩沖液洗滌3 次，4% 多聚甲醛固定， 加入0. 1% Triton X-100 作為細胞通透劑，1% BSA 封閉后加入以鼠源RV VP6 一抗和FITC標記的山羊抗鼠二抗，倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄各孔免疫熒光灶數，計算病毒滴度。病毒滴度（FFU·mL－1） = （最高稀釋倍數孔熒光灶數的平均值+ 相鄰較低稀釋倍數孔熒光灶數的平均值） / ［2×相鄰較低稀釋倍數×每孔加入的病毒稀釋液的體積（mL）］。

1. 7 實 時 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescencequantitative PCR，RT-qPCR）法檢測不同濃度羅伊氏乳桿菌作用后Caco-2細胞中RV VP6基因拷貝數 采用5×108、10×108、50×108、100×108、200×108 和500×108 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌侵襲Caca-2 細胞1 h， PBS 緩沖液洗滌5 次， 每孔加入MOI 為0. 01 的RV 感染Caco-2 細胞1 h，12 h 后收集各組細胞，TRIzol 法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA 后，采用RT-qPCR 法擴增檢測RV VP6 基因拷貝數，引物序列見表1。RT-qPCR的具體步驟按照TB Green? Premix Ex Taq TM （TliRNaseH Plus） 說明書操作。每個樣品平行測定3 次。擴增后得到Ct 值，并繪制標準曲線，計算病毒基因拷貝數，RV VP6 基因標準曲線由實驗室前期構建質粒所得：Y=-0. 298 7X+16. 613 （R2=0. 999 7，Y 代表Lg 病毒拷貝數，X 代表Ct 值）。

1. 8 羅伊氏乳桿菌與RV體內共培養動物模型建立 將25 窩SPF 級昆明乳鼠隨機分為對照組、RV 組（感染SA11 毒株）、Ab-NC 組（抗生素處理耗竭腸道菌群）、Ab-RV 組（耗竭腸道菌群后感染SA11毒株） 和Ab-Lac-RV 組（耗竭腸道菌群，并感染羅伊氏乳桿菌后感染SA11 毒株）， 每組5 窩， 每窩8～9 只乳鼠。Ab-NC 組、Ab-RV 組和Ab-Lac-RV 組乳鼠連續3 d 灌胃四聯抗生素100 μL （新生霉素1 g·L－1、萬古霉素0. 5 g·L－1、甲硝唑1 g·L－1 和氨芐西林1 g·L－1）。每日收集乳鼠糞便，采用LB 平板有氧培養和MRS 瓊脂平板厭氧培養檢測腸道菌群耗竭情況。RV 組和Ab-RV 組乳鼠連續10 d 灌胃6. 5 Lg FFU·mL－1 SA11 毒株，Ab-Lac-RV 組乳鼠上午感染100 μL 1010 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌，下午感染6. 5 Lg FFU·mL－1 SA11 毒株。NC 組和Ab-NC 組乳鼠灌胃PBS 緩沖液， 持續灌胃10 d。分別于灌胃第2、4、6、8 和10 天收集各組乳鼠糞便樣本，用于后續實驗。

1. 9 RT-qPCR法檢測各組乳鼠糞便中RV VP6基因拷貝數和結腸組織中免疫因子 mRNA表達水平 取各組乳鼠糞便， 均稱取相同質量， 加入等量PBS 緩沖液， 振蕩器震蕩3 次， 每次15 s， 4 ℃ 、12 000 r·min－1離心5 min，取250 μL 上清，TRIzol法提取總RNA， 反轉錄為cDNA， 采用RT-PCR 法檢測RV VP6 基因拷貝數，參考“1. 7”中方法。收集灌胃第4 天各組乳鼠結腸組織，稱取相同結腸組織質量， 加入800 μL PBS 緩沖液和5 顆研磨珠，置于研磨機上研磨2 min，離心后取400 μL上清， TRIzol 法提取RNA， 反轉錄為cDNA， 根據白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-8、IL-10、γ 干擾素（interferon- γ， IFN- γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 基因設計特異性引物， 進行RT-qPCR 實驗， 以GAPDH 作為內參基因，采用2—ΔΔCt 法計算各免疫因子mRNA 表達水平。引物序列見表1。

1. 10 統計學分析 采用 Origin2018 和 Graphpad"Prism 9. 0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞中RV VP6 基因拷貝數、免疫熒光灶數和病毒滴度，各組乳鼠糞便中RV VP6 基因拷貝數和結腸組織中免疫因子mRNA 表達水平均符合正態分布， 以x±s 表示。多組樣本間均數比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 羅伊氏乳桿菌鑒定和生長曲線 羅伊氏乳桿菌經活化和培養， 于MRS 瓊脂平板上生長良好，形態圓潤，呈圓形、光滑和乳白色的凸起樣菌落，且邊緣較整齊。革蘭染色后菌體呈紫色、不規則和方形桿狀。見圖1。羅伊氏乳桿菌經16s rDNA 測序后序列同源性為99%， 提示羅伊氏乳桿菌活化成功。見圖2。羅伊氏乳桿菌活菌數與A 值呈線性關系，回歸分析標準曲線為Y=0.437 5X+0.000 6，R2 = 0. 999 4。培養0～2 h，細菌處于對數生長期，細菌生長遲緩； 培養2～14 h， 細菌快速生長， 并于培養14～16 h 時細菌生長趨于穩定，培養16 h 時達到細菌生長速率頂峰，隨后進入衰亡期。見圖3。

2. 2 不同濃度羅伊氏乳桿菌感染后Caco-2細胞存活率 采用5×108、10×108、50×108、100×108和200×108 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌感染Caco-2 細胞，Caco-2 細胞存活率均gt;90% ， 因此后續實驗采用5×108、10×108、50×108、100×108 和200×108 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌進行細胞感染。見圖4。

2. 3 各組 Caco-2細胞中 RV VP6基因拷貝數 與PC 組比較，5×108、10×108、50×108、100×108和200×108 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌組Caco-2 細胞中RV VP6 基因拷貝數均明顯降低（Plt;0. 01）。見表2。

2. 4 各 組 Caco-2 細 胞 中 病 毒 滴 度 與 PC 組［（6. 383±0.021） Lg FFU·mL－1］ 比較，107、108、109 和1010 CFU·mL－1 羅伊氏乳桿菌組Caco-2 細胞中病毒滴度［（6. 247±0.042）、（6. 097±0.091）、（6. 030±0.075）和（5. 837±0.050） Lg FFU·mL－1］均明顯降低（Plt;0. 01）。見圖5。

2. 5 乳鼠腸道菌群耗竭模型和羅伊氏乳桿菌移植模型驗證 與對照組比較，Ab-NC組、Ab-RV組和Ab-Lac-RV 組乳鼠腸道菌群菌落數量均明顯減少，乳鼠腸道菌群耗竭成功。見圖6 和7。

2. 6 各組乳鼠糞便中 RV VP6基因拷貝數 灌胃第2 和4 天，與RV 組比較，Ab-RV 組乳鼠糞便中RV VP6 基因拷貝數明顯降低（Plt;0. 05）。灌胃第4、6、8 和10 天， 與Ab-RV 組比較， Ab-Lac-RV組乳鼠糞便中RV VP6 基因拷貝數明顯降低（Plt;0. 05）。見表3。

2. 7 各組乳鼠結腸組織中免疫因子 mRNA 表達水平 與對照組比較， Ab-RV 組和Ab-Lac-RV 組乳鼠結腸組織中IL-1β、IFN-γ 及TNF-α mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， IL-8mRNA 表達水平均明顯降低（Plt;0. 05）， Ab-Lac-RV 組乳鼠結腸組織中IL-10 mRNA 表達水平明顯升高（Plt;0. 01）。見表4。

3 討 論

在兒童常見的疾病中，急性腹瀉是僅次于呼吸道感染的第二大常見疾病，RV 是急性腹瀉最常見的觸發因素之一［12］。腸道微生物群在維持宿主健康中發揮重要作用。研究［13］ 顯示：微生物群的生態和功能與腸道病毒感染有關，病毒感染也可以改變腸道微生物的組成和活性。研究［14-17］ 顯示： 脊髓灰質炎病毒、呼腸孤病毒、諾如病毒和RV 均可影響腸道微生物群。部分共生細菌也已被證實可以通過多種機制增強腸道病毒的感染性，如細菌可以增強病毒顆粒的穩定性、幫助病毒吸附靶細胞和抑制抗病毒免疫反應等［18］。研究［19-22］ 發現：部分細菌也可以減弱腸道病毒的感染性，其中乳桿菌和雙歧桿菌能夠阻斷RV 的體外復制，分段絲狀菌可以預防和治療小鼠體內RV 的感染，克勞氏芽孢桿菌可以保護Caco-2 細胞免受RV 的感染。但目前對于羅伊氏乳桿菌與RV 相互作用的機制尚未完全闡明。

本研究前期研究［11］ 證實： RV 感染的乳鼠體內腸道微生物發生明顯變化，其中羅伊氏乳桿菌豐度明顯降低。本研究結果顯示： 羅伊氏乳桿菌與RV 共感染后，RV VP6 基因拷貝數和病毒滴度均明顯降低，這與FERNANDEZ-DUARTE 等［23］ 的研究結果一致。本研究結果顯示：與未經抗生素處理的感染RV 組比較，抗生素處理后感染RV 組乳鼠糞便中RV VP6 基因拷貝數明顯降低，提示腸道菌群對RV 的感染有一定的影響作用，腸道菌群的總體效應是促進RV 的感染，與DOMíNGUEZ-DíAZ 等［24］的研究結果一致。與抗生素處理后感染RV 組比較，羅伊氏乳桿菌RV 感染組VP6 基因拷貝數明顯降低，且隨著羅伊氏乳桿菌作用時間延長，VP6 基因拷貝數逐漸降低，提示羅伊氏乳桿菌可以在體內抑制RV 復制， 其作用時間越長， 抑制效果越好。當RV 入侵機體時，羅伊氏乳桿菌可能通過上調免疫因子IL-1β、IL-10、IFN-γ 和TNF-α mRNA 表達及下調免疫因子IL-8 mRNA 表達，抑制RV 復制。

綜上所述，羅伊氏乳桿菌可以通過調節免疫因子表達抑制RV 復制，為羅伊氏乳桿菌在預防和治療RV 相關疾病中的應用提供參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李小鳳參與研究選題、數據收集整理和論文撰寫，程美慧參與實驗操作， 劉洋和劉長城參與數據統計學分析，賈雪嬌和劉夢琦參與論文審校，趙微參與論文撰寫指導。

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