草蓯蓉多糖對(duì)THP-1 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討草蓯蓉多糖（BRPS）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法：將THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，采用LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞，建立炎癥模型。CCK-8 法檢測(cè)不同濃度（0、100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1） LPS 及不同濃度（0、12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1） BRPS 處理后THP-1 巨噬細(xì)胞存活率， 選取后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。將THP-1 巨噬細(xì)胞分為空白組、模型組、低劑量BRPS 組（25. 0 mg·L-1 BRPS）、中劑量BRPS 組（50. 0 mg·L-1 BRPS） 和高劑量BRPS 組（100. 0 mg·L-1 BRPS）。采用P38 抑制劑SB203580、ERK 抑制劑U0126、c-Jun 氨基末端激酶（JNK） 抑制劑SP600125 和核因子κB （NF-κB）抑制劑BAY11-7082 對(duì)THP-1 細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。另取THP-1 細(xì)胞， 分為對(duì)照組、LPS 組、抑制劑組、100. 0 mg·L-1 BRPS 組和抑制劑+100. 0 mg·L-1 BRPS 組。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 法檢測(cè)各組THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6 和IL-1β 水平， 2， 7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA） 熒光探針?lè)z測(cè)各組THP-1 巨噬細(xì)胞中活性氧（ROS） 水平，Hoechst33342/PI 熒光染色法觀察各組THP-1 巨噬細(xì)胞膜損傷情況，JC-1 熒光染色法觀察各組THP-1巨噬細(xì)胞線粒體膜電位，蛋白印跡法檢測(cè)各組THP-1 巨噬細(xì)胞中環(huán)氧合酶2 （COX-2）、高遷移率族蛋白B1 （HMGB1）、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 （NLRP3）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1、消皮素D （GSDMD）-N、IL-1β、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 和NF-κB 相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：CCK-8法檢測(cè)，LPS濃度為100～2 000 μg·L-1時(shí)，THP-1巨噬細(xì)胞存活率均gt;90%；與0 μg·L-1 LPS 組比較，100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1 LPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6水平均明顯升高（Plt;0. 05），提示巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，因此選用100 μg·L-1 LPS 構(gòu)建炎癥模型；12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1 BRPS 處理THP-1 巨噬細(xì)胞，THP-1 巨噬細(xì)胞存活率分別為91. 2%、93. 8%、91. 4%、90. 6% 和91. 8%，選取25. 0、50. 0 和100. 0 mg·L-1 BRPS 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中低、中和高劑量BRPS 組藥物濃度。ELISA 法檢測(cè)，與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF- α 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）； 與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。DCFH-DA 熒光探針?lè)z測(cè)，與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細(xì)胞中ROS 水平明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中ROS 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。Hoechst33342/PI熒光染色法觀察， 與空白組比較， 模型組THP-1 巨噬細(xì)胞膜損傷程度明顯增加； 與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞膜損傷程度明顯減少。JC-1 熒光染色法觀察， 空白組THP-1 巨噬細(xì)胞線粒體膜電位較高；與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細(xì)胞線粒體跨膜電位明顯降低；與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞線粒體跨膜電位逐漸升高。蛋白印跡法檢測(cè)，與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細(xì)胞中COX-2、HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N和IL-1β 蛋白表達(dá)水平及p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF- κB/NF-κB 比值均明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中HMGB1、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平及p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB 比值均明顯降低（Plt;0. 05），低劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05），高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中COX-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）；與對(duì)照組比較，LPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF- κB 比值及IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）；與LPS 組比較，抑制劑組、100 mg·L-1BRPS 組和抑制劑+100 mg·L-1 BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB 比值及IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）；與抑制劑組比較，抑制劑+100 mg·L-1 BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB 比值均明顯降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：BRPS抑制THP-1細(xì)胞巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與BRPS調(diào)控MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 草蓯蓉多糖； NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 ； 絲裂原活化蛋白激酶；核因子κB； 焦亡

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R285.5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

草蓯蓉，又稱(chēng)“不老草”，屬列當(dāng)科草蓯蓉屬植物，分布于中國(guó)長(zhǎng)白山、日本富士山和朝鮮北部山區(qū)［1］。草蓯蓉含有草蓯蓉多糖（Boschnikiarossica polysaccharides， BRPS）、草蓯蓉苷、草蓯蓉苯丙素苷和草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷等多種藥理成分［2］。草蓯蓉可全草入藥，味甘，具有補(bǔ)腎、壯陽(yáng)及保肝等功效［3］。中醫(yī)藥研究［4］ 發(fā)現(xiàn)滋腎清熱類(lèi)中草藥同時(shí)具有抗炎作用。研究［5-7］ 顯示BRPS 具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化應(yīng)激等藥理作用。BRPS 可溶于水，不良反應(yīng)少，具有非常廣泛的藥用價(jià)值，因此對(duì)BRPS 的研究具有重要意義［8］。

當(dāng)機(jī)體受到刺激后會(huì)產(chǎn)生防御反應(yīng)，此時(shí)炎癥反應(yīng)會(huì)被激活，進(jìn)行組織修復(fù)，但是過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)對(duì)機(jī)體組織產(chǎn)生損害［9］。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 （NOD-like receptor thermalprotein domain associated protein 3， NLRP3） 炎癥小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing aCARD， ASC） 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic specific protease，Caspase）-1 前體（Pro-Caspase-1） 組成的高分子蛋白復(fù)合物， 其激活后導(dǎo)致細(xì)胞釋放炎癥因子， 引起細(xì)胞焦亡［10］。經(jīng)典炎癥通路絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedprotein kinase，MAPK） 通路和核因子κB（nuclear factor kappa B， NF-κB） 通路可以激活下游NLRP3 炎癥小體［11］。NLRP3 炎癥小體激活后可將Pro-Caspase-1 剪切為具有活性的Caspase-1，此外活化的Caspase-1 切割打孔蛋白消皮素D（gasdermin D，GSDMD），隨后GSDMD 的N 端活性片段（GSDMD-N） 轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜磷脂層上并形成孔洞， 細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變， 最后細(xì)胞腫脹破裂，細(xì)胞失去調(diào)控物質(zhì)進(jìn)出的能力，釋放出細(xì)胞內(nèi)炎性因子，引發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)［12-13］。

脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 是細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要成分，可以與機(jī)體免疫系統(tǒng)中的受體結(jié)合， 進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)［14］。巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，其可通過(guò)分泌細(xì)胞炎癥因子參與機(jī)體免疫應(yīng)答。研究［15］ 發(fā)現(xiàn)： 佛波酯（phorbolmyristate acetate， PMA） 可誘導(dǎo)人單核白血病細(xì)胞THP-1 極化為巨噬細(xì)胞。但BRPS 通過(guò)MAPK 和NF-κB 通路對(duì)THP-1 巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用的具體機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究探討B(tài)RPS 的抗炎作用及其對(duì)MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路的影響，為BRPS 的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1. 1 藥物、細(xì)胞、主要試劑和儀器 BRPS （含量為86. 5%），常規(guī)醇沉法提取，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院尹宗柱教授惠贈(zèng)。THP-1 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。LPS 和PMA 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司， RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自以色列BI 公司， β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)ABclonal 公司，NLRP3 和Caspase-1 抗體購(gòu) 自 美 國(guó) Thermo 公 司，環(huán) 氧 合 酶 2（cyclooxygenase-2， COX-2）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein， HMGB1）、GSDMD-N、白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-1β、P38、磷酸化P38 （phosphorylated P38， p-P38）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulatedprotein kinases， ERK）、 磷 酸 化 ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）、磷酸化JNK（phosphorylated JNK， p-JNK）、NF- κB、磷酸化NF-κB （phosphorylated NF-κB， p-NF-κB） 和Lamin B1 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，人IL-1 β 、IL-6 和腫瘤壞死因子α （tumornecrosis factor- α， TNF- α） 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA） 試劑盒購(gòu)自美國(guó)RayBiotech 公司， 活性氧（reactiveoxidative species， ROS） 檢 測(cè) 試 劑 盒、Hoechst33342/PI 熒光染色試劑盒和線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司，核蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。CO2 培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek 公司，垂直板電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Azure Biosystems 公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)自重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1. 2 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)和 PMA 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 將THP-1 單核細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清和1% 抗生素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)2～3 d 后進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用100 pg·L-1 PMA 刺激THP-1 單核細(xì)胞48 h，誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，此時(shí)細(xì)胞為貼壁狀態(tài)［16-17］。

1. 3 CCK-8法檢測(cè)不同濃度LPS和BRPS處理后THP-1巨噬細(xì)胞存活率 將 THP-1巨噬細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 分別加入含0、100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1 LPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔，加入 CCK-8 試劑后，避光 2 h，于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定吸光度（A） 值，計(jì)算THP-1巨噬細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=測(cè)定孔A 值/空白孔A 值×100%另取THP-1 巨噬細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔， 分別加入含0、12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1 BRPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，加入CCK-8 試劑， 避光2 h 后，于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)定A 值， 計(jì)算THP-1 巨噬細(xì)胞存活率， 以選取后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。細(xì)胞存活率= 測(cè)定孔A 值/空白孔A 值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 4 ELISA 法檢測(cè)不同濃度 LPS 處理后 THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-6水平 將 THP-1巨噬細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按上述各組LPS 濃度進(jìn)行處理，24 h 后吸取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算不同濃度LPS 處理后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6 水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 5 細(xì)胞分組和處理 將 THP-1 細(xì)胞分為空白組、模型組、低劑量BRPS 組、中劑量BRPS 組和高劑量BRPS 組。空白組THP-1 細(xì)胞采用100 pg·L-1PMA 刺激48 h 分化為巨噬細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h。模型組THP-1細(xì)胞采用100 pg·L-1 PMA 刺激48 h， 加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后， 100 μg·L-1 LPS 處理1 h， 建立細(xì)胞炎癥模型。低、中和高劑量BRPS 組THP-1細(xì)胞采用100 pg·L-1 PMA 刺激48 h， 分別加入含25. 0、50. 0 和100. 0 mg·L-1 BRPS 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用100 μg·L-1 LPS 處理1 h［18］。采用P38 抑制劑SB203580、ERK 抑制劑U0126、JNK 抑制劑SP600125 和NF- κB 抑制劑BAY11-7082 對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。另取THP-1 細(xì)胞， 分為對(duì)照組、LPS 組、抑制劑組、100. 0 mg·L-1 BRPS 組和抑制劑+100. 0 mg·L-1 BRPS 組。各組THP-1 細(xì)胞采用100 pg·L-1 PMA 刺激48 h 分化為巨噬細(xì)胞。對(duì)照組THP-1 細(xì)胞不作任何處理； LPS 組THP-1細(xì)胞加入100 μg·L-1 LPS 作用1 h； 抑制劑組THP-1 細(xì)胞分別采用相應(yīng)濃度不同抑制劑處理后加入100 μg·L-1 LPS作用1 h，其中10 μmol·L-1SB203580 作用90 min， 10 μmol·L-1 U0126 作用90 min， 10 μmol·L-1 SP600125 作 用 30 min，30 μmol·L-1 BAY11-7082 作用60 min；100. 0 mg·L-1BRPS 組THP-1 細(xì)胞加入含100. 0 mg·L-1 BRPS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，加入100 μg·L-1 LPS 作用1 h；抑制劑+100. 0 mg·L-1 BRPS 組THP-1 細(xì)胞加入含100. 0 mg·L-1 BRPS 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，更換相應(yīng)濃度不同抑制劑處理，再加入100 μg·L-1 LPS 作用1 h。

1. 6 ELISA法檢測(cè)各組THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α和 IL-1β水平 將 THP-1巨噬細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 7 2，7- 二 氯 熒 光 素 二 乙 酸 酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針?lè)z測(cè)各組 THP-1 巨噬細(xì)胞中 ROS 水平 將THP-1 巨噬細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照ROS 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，各孔加入適當(dāng)稀釋好的DCFH-DA 試劑避光染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 軟件分析綠色熒光強(qiáng)度，以綠色熒光強(qiáng)度代表ROS 水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 8 Hoechst33342/PI熒光染色法觀察各組THP-1巨噬細(xì)胞膜損傷情況 將 THP-1 巨噬細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 按Hoechst33342/PI 熒光染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作， 各孔加入染色混合液（Hoechst33342 染液∶ PI 染液=1∶ 1）， 避光染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。Hoechst33342 染液可穿透細(xì)胞膜呈藍(lán)色， PI 染液不能穿透細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜破損時(shí)，Hoechst33342染液增強(qiáng)呈強(qiáng)藍(lán)色熒光， PI 染液可以將細(xì)胞膜破損的細(xì)胞染為強(qiáng)紅色熒光［19］。以Hoechst33342 染液和PI 染液染色強(qiáng)度代表各組THP-1 巨噬細(xì)胞膜損傷程度。

1. 9 JC-1熒光染色法觀察各組THP-1巨噬細(xì)胞線粒體膜電位 將THP-1巨噬細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，加入染色液避光染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照， 細(xì)胞中紅色熒光為JC-1 聚合物熒光染色， 綠色熒光為JC-1 單體熒光染色。以紅色熒光強(qiáng)度代表THP-1 巨噬細(xì)胞線粒體膜電位。

1. 10 蛋白印跡法檢測(cè)各組 THP-1巨噬細(xì)胞中炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平 收集 THP-1巨噬細(xì)胞并裂解細(xì)胞，提取總蛋白及核蛋白，煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，采用PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉后，加入一抗，β-actin （1∶10 000）、COX-2（1∶1 000）、HMGB1（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1 （1： 1 000）、GSDMD-N （1∶ 1 000）、IL-1β（1∶1 000）、p-P38（1∶2 000）、P38（1∶1 000）、p-ERK （1∶ 2 000）、 ERK （1∶ 1 000）、 p-JNK（1∶1 000）、JNK （1∶1 000）、p-NF-κB （1∶1 000）、NF-κB （1∶ 1 000） 和Lamin B1 （1∶ 1 000） 孵育過(guò)夜。相應(yīng)二抗稀釋?zhuān)?∶1 000），室溫孵育1 h 后顯色， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β -actin 內(nèi)參， 并計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 GraphPad Prism8. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組THP-1 巨噬細(xì)胞存活率、THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF- α 和IL-1β 水平及THP-1 巨噬細(xì)胞中炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度LPS和BRPS處理后THP-1巨噬細(xì)胞存活率及細(xì)胞培養(yǎng)液中 IL-6水平 LPS濃度為100～2 000 μg·L-1 時(shí)， LPS 對(duì)THP-1 巨噬細(xì)胞不顯示細(xì)胞毒性，THP-1 巨噬細(xì)胞存活率均gt;90%。與0 μg·L-1 LPS 組比較，100、200、500、1 000 和2 000 μg·L-1 LPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6水平均明顯升高（Plt;0. 05）， 提示巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)。本研究選用100 μg·L-1 LPS 處理THP-1 巨噬細(xì)胞1 h 作為炎癥模型的建立條件。見(jiàn)表1。

12. 5、25. 0、50. 0、100. 0 和200. 0 mg·L-1BRPS 處理THP-1 巨噬細(xì)胞，THP-1 巨噬細(xì)胞存活率分別為91. 2%、93. 8%、91. 4%、90. 6% 和91. 8%，提示BRPS 對(duì)THP-1 巨噬細(xì)胞不顯示細(xì)胞毒性。因此，選取25. 0、50. 0和100. 0 mg·L-1 BRPS作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中低、中及高劑量BRPS 組的藥物濃度。

2. 2 各組THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α和IL-1β水平 與空白組比較，模型組THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α 及IL-1β 水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)表2。

2. 3 各組THP-1巨噬細(xì)胞中ROS水平 與空白組（52. 68±2. 55） 比較， 模型組THP-1 巨噬細(xì)胞中ROS 水平（175. 02±11. 56） 明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中ROS 水平（166. 87±12. 32、136. 92±4. 30 和85. 91±10. 35） 均明顯降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖1。

2. 4 各組THP-1巨噬細(xì)胞膜損傷情況 與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細(xì)胞中Hoechst33342 染液和PI 染液染色增強(qiáng)， THP-1 巨噬細(xì)胞膜損傷程度明顯加重。與模型組比較，低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中Hoechst33342 染液和PI 染液染色減弱， THP-1 巨噬細(xì)胞膜損傷程度明顯減輕。見(jiàn)圖2。

2. 5 各組THP-1巨噬細(xì)胞線粒體膜電位 空白組JC-1 聚合物紅色熒光較強(qiáng)， JC-1 單體綠色熒光較弱， 提示THP-1 巨噬細(xì)胞線粒體膜電位較高。與空白組比較， 模型組THP-1 巨噬細(xì)胞線粒體跨膜電位明顯降低。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞線粒體跨膜電位逐漸升高。見(jiàn)圖3。

2. 6 各組THP-1巨噬細(xì)胞中COX-2和HMGB1蛋白表達(dá)水平 與空白組比較，模型組 THP-1巨噬細(xì)胞中COX-2 和HMGB1 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 中劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中HMGB1 蛋白表達(dá)水平和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中COX-2 和HMGB1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05），低劑量BRPS組THP-1 巨噬細(xì)胞中COX-2 和HMGB1 蛋白表達(dá)水平和中劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖4。

2. 7 各組 THP-1巨噬細(xì)胞中 NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 和 IL-1β 蛋白表達(dá)水平 與空白組比較，模型組THP-1 巨噬細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低、中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）， 中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中GSDMD-N 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05），低劑量BRPS 組THP-1巨噬細(xì)胞中GSDMD-N 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖5。

2. 8 各組 THP-1巨噬細(xì)胞中 p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和 p-NF-κB/NF-κB比值及 IL-1β蛋白表達(dá)水平 與空白組比較，模型組 THP-1巨噬細(xì)胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF- κB/NF- κB 比值均明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 中和高劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF- κB/NF- κB 比值均明顯降低（Plt;0. 05）， 低劑量BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中p-P38/P38 、p-ERK/ERK 、p-JNK/JNK 和p-NF- κ B/NF- κ B 比值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)圖6 和7及表3。與對(duì)照組比較，LPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB比值及IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。與LPS 組比較，抑制劑組、100 mg·L-1 BRPS 組和抑制劑+100 mg·L-1 BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞中p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-NF-κB/NF-κB 比值及IL-1β 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與抑制劑組比較， 抑制劑+100. 0 mg·L-1BRPS 組THP-1 巨噬細(xì)胞p-P38/P38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 和p-NF-κB/NF-κB 比值均明顯降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖8～11。

3 討 論

炎癥反應(yīng)是免疫系統(tǒng)對(duì)于病原體、受損細(xì)胞和有毒化合物等有害刺激作出的防御反應(yīng)，通過(guò)多種炎癥信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，以清除有害刺激維持機(jī)體平衡［20］。巨噬細(xì)胞在受到刺激后參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生并釋放［9］。IL-1β 是IL-1 基因家族中典型的促炎因子， 可由LPS 直接刺激產(chǎn)生也可由TNF- α 誘導(dǎo)產(chǎn)生， 同時(shí)也可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α 及其自身的分泌， 在炎癥反應(yīng)中相互協(xié)調(diào)作用［21］。炎癥因子的大量釋放可引起COX-2 高表達(dá)［22］。同時(shí)， 產(chǎn)生的炎癥因子可促進(jìn)HMGB1 與相應(yīng)受體相互作用， 激活下游炎癥通路［23］。本研究結(jié)果顯示：BRPS 預(yù)處理后，THP-1 巨噬細(xì)胞中炎癥因子水平和COX-2 及HMGB1 蛋白表達(dá)水平降低，提示BRPS 可減少炎癥因子的釋放，從而降低炎癥反應(yīng)。

ROS 主要來(lái)源于線粒體， 其產(chǎn)生不僅會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，還可引發(fā)炎癥反應(yīng)。線粒體功能發(fā)生障礙時(shí)， 可產(chǎn)生大量ROS， ROS 的釋放也可促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的激活［24-25］。NLRP3 炎癥小體組裝后，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡的發(fā)生，同時(shí)IL-1β 可經(jīng)受損的細(xì)胞膜釋放， 加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)［26］。本研究結(jié)果顯示：BRPS 預(yù)處理后可降低THP-1 巨噬細(xì)胞中ROS 水平、升高線粒體跨膜電位并減輕細(xì)胞膜損傷情況，降低THP-1 巨噬細(xì)胞中NLRP3 、Caspase-1、GSDMD-N 和IL-1β蛋白表達(dá)水平。提示BRPS 可減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，有效減輕細(xì)胞膜損傷情況，并抑制細(xì)胞炎癥小體活化及焦亡。

MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路是經(jīng)典的促炎信號(hào)通路，均可通過(guò)上調(diào)炎癥因子的合成，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)［27］。MAPK 主要包括P38、ERK 和JNK 共3 個(gè)亞家族， 可通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)［28］。NF-κB 經(jīng)典通路通常由LPS 等與細(xì)胞上的相關(guān)受體結(jié)合而介導(dǎo)活化，NF-κB 活化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)以調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。研究［18］ 顯示：BRPS 可通過(guò)MAPK 和NF- κB 信號(hào)通路減輕RAW264. 7 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：BRPS 降低THP-1 巨噬細(xì)胞中P38、ERK、JNK 和NF-κB 磷酸化水平，并通過(guò)MAPK 和NF-κB 通路抑制劑驗(yàn)證具有相同結(jié)果，提示BRPS 抗炎作用可能與MAPK 和NF-κB 通路有關(guān)。

綜上所述， BRPS 可通過(guò)MAPK 和NF- κB 信號(hào)通路減輕LPS 誘導(dǎo)的THP-1 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，本研究結(jié)果為BRPS 的臨床應(yīng)用提供了參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馬新月、刁佳雯和徐慧參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取及分析，金愛(ài)花參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫(xiě)，全吉淑參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文修改及審校。

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