香葉木素對(duì)RSL3 誘導(dǎo)小鼠精母細(xì)胞GC-2 鐵死亡的抑制作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討香葉木素（DIO） 對(duì)谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px） 抑制劑 （1S，3R）-RSL3（RSL3） 誘導(dǎo)小鼠精母細(xì)胞GC-2鐵死亡的抑制作用，并闡明相關(guān)作用機(jī)制。方法：GC-2細(xì)胞分為對(duì)照組、RSL3 組、RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1DIO 組和RSL3+ 鐵死亡抑制劑Ferrostain-1 （Fer-1） 組（200 nmol·L-1 Fer-1）。分別采用0、1、5、10、50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 溶液及0、0. 1、0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1DIO 溶液處理細(xì)胞。另取GC-2 細(xì)胞，分為空白組、模型組和給藥組，給藥組GC-2 細(xì)胞按照處理方式分為0. 8、4. 0 和20. 0 nmol·L-1 DIO 組及RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組。噻唑藍(lán)（MTT） 法檢測(cè)各組GC-2 細(xì)胞存活率。采用100 nmol·L-1RSL3 分別作用GC-2 細(xì)胞0、6、12、24、36 和48 h，Western blotting 法檢測(cè)各組GC-2 細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。試劑盒檢測(cè)各組GC-2 細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD） 活性和丙二醛（MDA） 水平及谷胱甘肽（GSH） /氧化型谷胱甘肽（GSSG） 比值，免疫熒光法觀察各組GC-2 細(xì)胞中酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4） 蛋白熒光強(qiáng)度。結(jié)果：MTT法檢測(cè)，與0 nmo·l L－1 RSL3 組比較，50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01）； 與0 μmol·L-1DIO 組比較，0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1 DIO 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01），后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇100 nmol·L-1 RSL3 作用GC-2 細(xì)胞，DIO 作用濃度lt;0. 1 μmol·L-1。與空白組比較，模型組GC-2 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 01）；與模型組比較，RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測(cè)，與0 h 比較，RSL3 作用6 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中GPX4蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01），RSL3 作用12 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用24 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中GPX4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用36 和48 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）；將100 nmol·L-1 RSL3 作用GC-2 細(xì)胞12 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。與對(duì)照組比較，RSL3 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01），SOD 活性和GSH/GSSG比值均明顯降低（Plt;0. 05）；與RSL3 組比較，RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1組GC-2 細(xì)胞中GSH/GSSG 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。免疫熒光法觀察，與對(duì)照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)； 與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度均明顯減弱。Western blotting 法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，RSL3 組GC-2 細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），GPX4和FTH1蛋白表達(dá)水平均明顯升高 （Plt;0. 05或Plt;0. 01）。結(jié)論：DOI能夠減輕RSL3誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞GC-2 鐵死亡，其機(jī)制可能與抑制HO-1 蛋白表達(dá)，上調(diào)GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 鐵死亡； 香葉木素； 小鼠精母細(xì)胞GC-2 ； 谷胱甘肽過氧化酶4 ； 鐵蛋白重鏈1；酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4

［中圖分類號(hào)］ R966 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

男性不育是全球范圍內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。精子的生成和發(fā)育是男性生殖能力的重要組成部分，精母細(xì)胞作為精子的祖細(xì)胞在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，主要負(fù)責(zé)生殖細(xì)胞的生成和發(fā)育［1］。研究［2］ 顯示： 鄰苯二甲酸單2 乙基己酯通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrinreceptor protein， TFR） 1 作用介導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞出現(xiàn)谷胱甘肽（glutathione，GSH） 代謝紊亂、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，從而引起鐵死亡，最終導(dǎo)致血睪屏障受損，并產(chǎn)生雄性生殖毒性。由于鐵對(duì)雄性生殖能力具有重要作用，因此，探討鐵死亡對(duì)生殖活性的影響為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。鐵死亡是一種由于鐵離子在細(xì)胞內(nèi)積累過多而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡方式［3］。血紅素加氧酶1 （hemeoxygenase-1，HO-1）是細(xì)胞中鐵的重要來源之一，可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生［4］。除此之外，轉(zhuǎn)鐵蛋白通過TFR 介導(dǎo)鐵攝取，鐵蛋白重鏈1 （ferritin heavychain 1， FTH1） /鐵蛋白輕鏈（ferritin light chain，F(xiàn)TL） 通過自噬降解可以升高細(xì)胞內(nèi)鐵水平，從而促進(jìn)鐵死亡發(fā)生［5］。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4） 是細(xì)胞中唯一能夠?qū)⒅|(zhì)過氧化物還原成脂質(zhì)的酶，也在鐵死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。在小鼠精母細(xì)胞中，適量的鐵是必需的，但過量的鐵會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)增加， 從而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能［7］。研究［8］ 發(fā)現(xiàn)：鐵離子平衡失調(diào)和鐵離子過載可能與男性不育有關(guān)。過量的鐵離子會(huì)引發(fā)精子發(fā)生過程中的氧化損傷，導(dǎo)致精子形態(tài)異常、運(yùn)動(dòng)能力降低和DNA 損傷，從而影響精子質(zhì)量和生育能力［9］。提示小鼠精母細(xì)胞鐵死亡可能與男性不育有關(guān)，但仍需要進(jìn)一步的研究分析二者之間的具體關(guān)系和作用機(jī)制。香葉木素（diosmetin，DIO） 是一種天然黃酮類化合物，在自然界中分布廣泛，多存在于菊花、檸檬、柑橘和橄欖葉等多種植物中［10］。DIO 因其抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌特性等多種生物活性在非酒精性脂肪性肝病、炎癥性腸病及急性腎損傷等疾病中表現(xiàn)出保護(hù)作用［11-14］，但DIO 能否通過調(diào)節(jié)鐵死亡改善男性不育尚未完全闡明。本研究探討DIO 對(duì)谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione， peroxidase，GSH-Px） 抑制劑（1S， 3R）-RSL3 （RSL3） 誘導(dǎo)的GC-2 細(xì)胞鐵死亡的影響，闡明其調(diào)控小鼠精母細(xì)胞鐵死亡抑制生殖毒性的作用，以期為臨床治療男性不育提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 小鼠精母細(xì)胞 GC-2購自美國ATCC 細(xì)胞庫。鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3 購自美國Selleck 公司， DIO 購自美國Sigma 公司， 高糖培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司，胎牛血清購自上海VivaCell 公司， 噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）和鐵死亡抑制劑Ferrostain-1 （Fer-1） 購自上海MCE 公司， 還原型GSH、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione， GSSG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 試劑盒和DAPI 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，胰酶、1% 青- 鏈霉素和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自生工生物工程（上海） 股份有限公司，丙二醛（malondialdehyde， MDA） 試劑盒購自安徽Biosharp 公司，F(xiàn)TH1 抗體（批號(hào)：A19544） 購自武漢Abclonal公司，GPX4抗體（批號(hào)：381958） 購自成都ZEN-BIOSCIENCE 公司，酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4 （acyl-CoA synthetase long-chainfamily member 4， ACSL4） 抗體（ 批號(hào)：22401-1-AP）、HO-1 抗體（批號(hào)：10701-1-AP） 和β -tubulin 抗體（批號(hào)： 00124309） 購自美國Proteintech 公司， 山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， 山羊抗兔紅色熒光二抗購自美國Jackson 公司。蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad 公司，5804 R 超速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，AI600 成像儀購自美國General Electric 公司，倒置熒光顯微鏡和NIS-Elements 激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon 公司， SYNERGY H1 多功能酶標(biāo)儀購自美國 BioTek 公司， CO2 培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1. 2 GC-2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 GC-2 細(xì)胞采用含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 換液1 次，待細(xì)胞生長2～3 d，細(xì)胞融合度約80% 時(shí)，加入胰酶消化30 s， 進(jìn)行細(xì)胞傳代處理。GC-2 細(xì)胞分為對(duì)照組、RSL3 組、RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmo·l L-1 DIO組、RSL3+20. 0 nmo·l L-1DIO 組和RSL3+Fer-1 組（200 nmol·L-1 Fer-1）。

1. 3 MTT 法檢測(cè)不同濃度 RSL3 和 DIO 作用后GC-2 細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長期 GC-2 細(xì)胞，以5×104 mL-1的細(xì)胞密度接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，按十字形晃動(dòng)孔板，使細(xì)胞均勻分散，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別采用500 μL 終濃度為0、1、5、10、50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 溶液處理細(xì)胞。另取GC-2 細(xì)胞，按上述方式培養(yǎng)后，分別采用500 μL終濃度為0、0. 1、0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1 DIO 溶液處理細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h， 取出后每孔加入5 g·L-1 MTT 溶液50 μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，輕輕吸棄培養(yǎng)基，每孔加入500 μL DMSO 溶液， 放置于搖床上振蕩15 min， 采用酶標(biāo)儀于波長570 nm 和630 nm 處測(cè)定吸光度（A） 值， 計(jì)算GC-2 細(xì)胞存活率， 篩選RSL3 和DIO 最適作用濃度。細(xì)胞存活率= （實(shí)驗(yàn)孔A 值- 空白孔A 值） / （對(duì)照孔A 值- 空白孔A 值） ×100%。

1. 4 MTT法檢測(cè)各組 GC-2細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長期GC-2 細(xì)胞，按照“ 1. 3” 中方法培養(yǎng)。將GC-2 細(xì)胞分為空白組、模型組和給藥組。空白組使用完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)GC-2 細(xì)胞，模型組GC-2細(xì)胞加入500 μ L 終濃度為100 nmol·L-1 RSL3溶 液， 給 藥 組 GC-2 細(xì) 胞 分 為 0. 8、 4. 0 和20. 0 nmol·L-1 DIO 組（分別加入終濃度為0. 8、4. 0 和 20. 0 nmol·L-1 DIO 溶 液） 及 RSL3 +0. 8 nmo·l L-1 DIO組、RSL3+4. 0 nmo·l L-1 DIO組和RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組（ 分別加入100 nmol·L-1 RSL3 溶液和終濃度為0. 8、4. 0 及20. 0 nmol·L-1 DIO 溶液）。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，每孔加入5 g·L-1 MTT 溶液50 μL，繼續(xù)孵育4 h 后，按照“1. 3”中方法，計(jì)算GC-2 細(xì)胞存活率。

1. 5 Western blotting法檢測(cè) RSL3作用不同時(shí)間后各組GC-2細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長期GC-2 細(xì)胞，以4×105 mL-1 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 每孔加入2 mLDMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中過夜，取出后加入100 nmol·L-1 RSL3 溶液分別處理細(xì)胞0、6、12、24、36 和48 h。預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS） 洗滌1 次，裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定蛋白含量，100 ℃加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)凝膠電泳轉(zhuǎn)至PVDF 膜后，于5% 脫脂奶粉中封閉1 h。分別加入FTH1（1∶1 000）、GPX4 （1∶1 000）、HO-1 （1∶2 000） 和β-tubulin抗體（1∶40 000），室溫孵育2 h 或4 ℃孵育過夜。回收一抗，TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST 溶液洗滌3 次，每次10 min。于PVDF 膜上滴加化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像儀顯影成像， 以β-tubulin 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 6 試劑盒檢測(cè)各組 GC-2 細(xì)胞中 SOD 活性和MDA水平及GSH/GSSG比值 取對(duì)數(shù)生長期GC-2細(xì)胞， 以4×105 mL-1 的細(xì)胞密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照“1. 2”中分組及給藥，按照試劑盒說明書操作， 檢測(cè)各組GC-2 細(xì)胞中SOD 活性和MDA 水平及GSH/GSSG 比值。

1. 7 免疫熒光法觀察各組 GC-2 細(xì)胞中 ACSL4蛋 白熒光強(qiáng)度 取對(duì)數(shù)生長期 GC-2細(xì)胞，以 2×105 mL-1 的細(xì)胞密度接種于預(yù)先加入爬片的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜。按照“1. 2”中分組及給藥，吸去培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌1 次。加入1 mL4% 多聚甲醛組織固定液， 固定30 min 后吸棄干凈，PBS 緩沖液洗滌3 次，將爬片取1 塊放置于載玻片上， 圈出染色區(qū)域， PBS 緩沖液輕輕潤洗1 次， 每次5 min。0. 5% Triton X-100 作用10 min后， PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次3 min； 用染色封閉液于37 ℃封閉1 h，ACSL4 一抗（1∶100） 滴加至染色區(qū)域，4 ℃孵育過夜；回收一抗，PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次5 min； 山羊抗兔二抗（1∶ 10 000）滴加至染色區(qū)域，濕盒中室溫孵育1 h；吸棄二抗，PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次5 min， 避光； DAPI溶液（1 ∶ 1 000） 滴加至染色區(qū)域，室溫孵育10 min；吸棄溶液，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min， 避光。激光共聚焦顯微鏡采集圖片， 觀察CG-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度。以紅色熒光代表ACSL4 蛋白表達(dá)情況，紅色熒光越強(qiáng)，ACSL4蛋白表達(dá)越強(qiáng)； 紅色熒光越弱， ACSL4 蛋白表達(dá)越弱。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 Graphpad Prism 8. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率， 細(xì)胞中SOD 活性、MDA 水平和GSH/GSSG 比值及鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度RSL3和DIO作用后GC-2細(xì)胞存活率 與0 nmol·L-1 RSL3 組比較，50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。與0 μmol·L-1 DIO 組比較， 0. 5、1. 0、5. 0、10. 0 和50. 0 μmol·L-1 DIO 組GC-2 細(xì)胞存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇100 nmol·L-1 RSL3 作用GC-2 細(xì)胞， DIO 作用濃度lt;0. 1 μmol·L-1。見表1 和2。

2. 2 各組GC-2細(xì)胞存活率 與空白組比較，模型組GC-2 細(xì)胞存活率明顯降低（Plt;0. 01）。與模型組比較，RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組細(xì)胞存活率明顯升高（Plt;0. 01）。見表3。

2. 3 RSL3作用不同時(shí)間后GC-2細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與 0 h 比較，RSL3 作用 6 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中GPX4 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）， RSL3 作用12 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用24 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中GPX4 和HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3 作用36 和48 h 時(shí)GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 01）。將100 nmol·L-1RSL3 作用GC-2 細(xì)胞12 h 作為構(gòu)建GC-2 細(xì)胞鐵死亡細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)條件。見圖1 和表4。

2. 4 各組 GC-2 細(xì)胞中 SOD 活性和 MDA 水平及GSH/GSSG比值 與對(duì)照組比較，RSL3組GC-2細(xì)胞中MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01），SOD 活性和GSH/GSSG 比值均明顯降低（Plt;0. 05）。與RSL3 組 比 較， RSL3 + 0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3 + 4. 0 nmol· L-1 DIO 組、 RSL3 +20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）， RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中GSH/GSSG 比值均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表5。

2. 5 各組 GC-2細(xì)胞中 ACSL4蛋白熒光強(qiáng)度 與對(duì)照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、 RSL3 + 4. 0 nmol·L-1DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1 DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中ACSL4 蛋白熒光強(qiáng)度均明顯減弱。見圖2。

2. 6 各組 GC-2細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較， RSL3 組GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4 和FTH1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。與RSL3 組比較， RSL3+0. 8 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+4. 0 nmol·L-1 DIO 組、RSL3+20. 0 nmol·L-1DIO 組和RSL3+Fer-1 組GC-2 細(xì)胞中HO-1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖3 和表6。

3 討 論

男性不育與細(xì)胞中鐵水平有密切關(guān)聯(lián)。研究［15］ 顯示：鐵水平不足時(shí)精子數(shù)量減少，進(jìn)而影響男性不育。鐵離子在鐵死亡過程中發(fā)揮重要作用，血液循環(huán)中的Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合并運(yùn)輸，通過TFR1 進(jìn)入細(xì)胞后，被還原并釋放至細(xì)胞質(zhì)的不穩(wěn)定鐵池中，多余的鐵貯存于鐵蛋白中。細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池主要以Fe2+的形式存在，由于Fe2+的不穩(wěn)定性和高反應(yīng)活性， 鐵通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，可直接與細(xì)胞膜和質(zhì)膜中的多不飽和脂肪酸反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）， 導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［16］。研究［17］ 發(fā)現(xiàn)：RSL3 能夠直接抑制GPX4 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。本研究結(jié)果顯示：RSL3 處理12 h 時(shí)鐵死亡相關(guān)蛋白FTH1 和GPX4 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，HO-1 蛋白表達(dá)上調(diào)， 表明RSL3 處理12 h 是GC-2 細(xì)胞鐵死亡模型建立的最適條件。經(jīng)RSL3 處理后GC-2 細(xì)胞中MDA 水平明顯升高， SOD 活性和GSH/GSSG 比值明顯降低， HO-1 蛋白表達(dá)水平明顯升高，GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)水平明顯降低且ACSL4蛋白熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，提示GC-2 細(xì)胞鐵死亡模型造模成功，RSL3 作用的GC-2 細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

鐵死亡是與鐵代謝及脂質(zhì)代謝相關(guān)的一種新型細(xì)胞死亡方式， 其主要的生化特征表現(xiàn)為ROS聚積、GSH 合成減少、過氧化產(chǎn)物MDA 堆積和Fe2+水平升高［18］。GPX4 作為GSH-Px 家族成員，能夠抑制脂質(zhì)過氧化過程， 將脂質(zhì)氫過氧化物還原為脂質(zhì)醇，使得ROS 累積減少，從而抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生［19］。GSH 是GSH-Px 清除脂質(zhì)過氧化物的必需輔助因子， GSH 減少， GSH-Px 活性降低，細(xì)胞抗過氧化能力降低，脂質(zhì)過氧化物堆積，最后細(xì)胞發(fā)生鐵死亡［20］。HO-1 是由Hmox1 基因編碼的應(yīng)激反應(yīng)酶， 能夠催化血紅素的分解， 產(chǎn)生一氧化碳、亞鐵和膽紅素等一系列具有生物學(xué)效應(yīng)的代謝產(chǎn)物。鐵是血紅素中的重要元素， 因此HO-1 也與鐵代謝密切相關(guān)［21］。HO-1 在組織損傷、炎癥、缺氧和氧化應(yīng)激等情況下會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)， 進(jìn)而減少血紅素的蓄積， 促進(jìn)鐵的釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)［22］。同時(shí)， HO-1 的誘導(dǎo)也可促進(jìn)鐵的儲(chǔ)存和利用， 通過參與鐵代謝調(diào)節(jié)保護(hù)人體免受氧化應(yīng)激等傷害［23-24］。研究［25］ 發(fā)現(xiàn)：肝星狀細(xì)胞中HO-1敲低導(dǎo)致細(xì)胞中ROS 水平升高并誘導(dǎo)鐵死亡，表明HO-1 作為鐵死亡相關(guān)蛋白之一，在鐵死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。生物體內(nèi)的鐵元素除結(jié)合在血紅蛋白中的鐵離子外， 還有部分儲(chǔ)存于鐵蛋白中。鐵蛋白以可溶性、無毒和易獲取的形式儲(chǔ)存鐵， 對(duì)于維持鐵穩(wěn)態(tài)和保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷至關(guān)重要［26］。鐵蛋白主要由FTH1 和FTL 2 個(gè)亞基組成。其中FTH1 具有亞鐵氧化酶活性， 可將機(jī)體內(nèi)過剩的鐵催化成Fe3+并儲(chǔ)存于鐵蛋白復(fù)合物中，維持正常的鐵穩(wěn)態(tài)，同時(shí)也具有抗氧化應(yīng)激功能，在吸收和釋放鐵方面， 能夠降解自由基有效阻止由過量鐵引起的氧化損害［27-28］。FTH1 參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞過程， 包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和鐵死亡等，與疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)［29-31］。

研究［32］ 證實(shí)：DIO 通過抑制細(xì)胞中ROS 產(chǎn)生和MDA 形成發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用，還可通過減輕炎癥和鐵死亡抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的乳腺炎。本研究結(jié)果顯示：DIO 能夠降低RSL3 誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞GC-2 中MDA 水平，升高GSH/GSSG 比值和SOD 活性， 并下調(diào)鐵死亡相關(guān)蛋白HO-1 蛋白表達(dá)，上調(diào)GPX4 和FTH1 蛋白表達(dá)。

綜上所述， DIO 可減輕RSL3 處理的GC-2 細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物積累，其機(jī)制可能與抑制HO-1蛋白表達(dá)和上調(diào)GPX4 及FTH1 蛋白表達(dá)有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：馬寶蓮參與研究選題、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)收集、整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及論文撰寫，胡曉雪和艾霄文參與實(shí)驗(yàn)操作及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，張永蘭參與研究選題、數(shù)據(jù)收集和整理及論文撰寫和審校。

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