提升甜菜紅色素光熱穩定性的微乳液包封制備的研究

摘 要：本文采用助表面活性劑濃度法制備微乳液并將甜菜色素包封在W/O型微乳液體系內，以提升甜菜色素的光、熱穩定性。結果發現，在pH3～7條件下色素比較穩定。通過條件優化得到甜菜色素微乳液的最佳制備工藝配方并得出以下數據：微乳體系中的水相占比為14.2%，葵花籽油占比為42.9%，混合乳化劑占比為42.9%，甜菜色素最大承載量約為1.42%。此外，制備的甜菜色素微乳液經鑒定為W/O型乳液，具有良好的體系穩定性，穩定性試驗結果表明，微乳化對甜菜色素的光、熱穩定性具有一定的提升效果。研究結果為甜菜色素的加工及其產品開發提供了理論基礎。

關鍵詞：甜菜色素；油包水；微乳液；穩定性

中圖分類號： TS 201 文獻標志碼：A

顏色是評價食品的一項重要指標，色素可分為天然色素和人工合成色素。甜菜色素作為一種生物堿類天然色素，它不僅可以作為食品添加劑提供染色效果，而且還能作為一種生物活性物質提供保健功能。而甜菜色素的油不溶性和本身穩定性較低是制約其應用的最主要因素[1]。將甜菜色素制備成W/O型乳液后，不僅可以提升其本身的呈色穩定性，而且可以促進人們腸道吸收，能較大程度地發揮甜菜色素的保健作用。為了最大化乳液中的色素含量和提高乳液體系的穩定性，通過制作甜菜色素微乳液的方式研究微乳液體系的臨界增溶水相條件，以獲得甜菜色素含量高且體系穩定的甜菜色素乳液。本文對甜菜色素在不同pH體系下的呈色穩定性進行測定，以確定最適的水相pH范圍，以此為基礎展開甜菜色素微乳液制作方法的單因素試驗，得出甜菜色素微乳液的最佳制備工藝，并通過對比甜菜色素微乳液與水溶液在光照、加熱條件下的色素保留率，探究微乳液對甜菜色素穩定性的保護效果及甜菜色素微乳液體系的穩定性。研究結果可為甜菜色素的加工及其產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜菜色素粉末，上海百靈威化學技術有限公司；葵花籽油，中國上海佳格食品有限公司；司班80、吐溫80、檸檬酸、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氫氧化鈉、丙三醇、無水乙醇（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AL 104電子天平、PL 2002電子天平、Five Easy實驗室pH計，梅特勒-托利多（上海）有限公司；RHdigital型磁力攪拌器、VORTEX GENIUS 3 型旋渦振蕩器、ULTRA-TURRAX T 18 basic 型高速分散器，德國IKA公司；SPECTRA MAX 190型全波長酶標儀，美國Molecular Devices公司；Centrifuge 5424離心機，德國Eppendorf公司；CU-420型電熱恒溫水槽，上海一恒科學儀器有限公司；GZP-150N光照培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；Smart-S2-30DH型實驗室級超純水機，南京易普易達科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜菜色素在不同pH下的呈色穩定性

用去離子水分別配置pH為3、5、7的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L）、pH為9的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液（0.05mol/L）、pH為11的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖溶液（0.05mol/L）。用不同pH的緩沖溶液精確配置0.1%的甜菜色素溶液。配置完成后在室溫下避光放置60min，觀察不同pH下色素溶液的顏色變化。用全波長酶標儀對不同pH的色素溶液進行200nm～700nm的全波長掃描，加樣量200μm，溫度為常溫，波長取10nm，記錄全波長掃描圖譜。

1.3.2 甜菜色素微乳液制備方法的確定

甜菜色素微乳液制備方法如下。1）混合乳化劑的復配。參照文獻[2]～文獻[4]進行乳化劑的選擇和復配，選擇親油的司班80（HLB值為4.3）與親水的吐溫80（HLB值為15）進行復配，以獲得較大的HLB值范圍。調整司班80與吐溫80的比例分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，計算得混合乳化劑的HLB值分別為5.37、6.44、7.51、8.58、9.65。2）甜菜色素微乳液的制備。微乳液的加料順序采用助乳化劑濃度法[5]，先固定助乳化劑與水相的比例，并按照比例將助乳化劑溶于初始水相配置成新水相，混合乳化劑和葵花籽油組成油相，再逐滴將新水相滴加油相中制備微乳液，滴加過程中磁力攪拌（800rad/min）。3）擬三元相圖的繪制。固定油相的總質量為10g，葵花籽油和混合乳化劑的比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9，混合乳化劑中司班80與吐溫80的比例分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，選擇50%的丙三醇作為助表面活性劑，初始水相是pH為5的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L）。按照上述比例稱取相應的葵花籽油、司班80和吐溫80混合均勻作為油相，在pH為5的緩沖溶液中以質量比5∶5加入丙三醇作為新水相，然后按照1.3.2（2）中的方法制備微乳液。根據到達臨界增溶水時（乳液由澄清透明變渾濁），乳液中葵花籽油、混合乳化劑、新水相的百分比來確定該點在相圖中的位置，將每個臨界點連成曲線即得到該體系的擬三元相圖。4）助表面活性劑的選擇。在根據三元相圖確定油相中各組分的含量后，研究無水乙醇和丙三醇對臨界增溶水相的影響。5）助表面活性劑濃度的確定。根據1.3.2（4）的結果研究助表面活性劑濃度為30%、40%、50%、60%（w/w）時對臨界增溶水相的影響。6）甜菜色素最大添加量的確定。根據1.3.2其余步驟的結果，測定甜菜色素粉末在含有50%丙三醇的pH5磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中的最大溶解度，以接近最大溶解度的溶液作為水相制備微乳液，計算臨界點的最大增溶水相和色素含量。

1.3.3 甜菜色素微乳液的表征

在確定甜菜色素微乳液各組分含量后，按照制備方法制備甜菜色素含量為1.0%的微乳液并對其進行表征。1）微乳液類型的鑒定。采用染色法[6]對甜菜色素微乳液的類型進行鑒定。取一定量的微乳液置于培養皿中，在微乳液的中心滴入一滴亞甲基藍染劑，如果乳液為O/W型，那么染劑會快速從中心擴散至整個乳液，反之乳液為W/O型。滴入染劑后常溫靜置30min，觀察染色狀態。2）微乳液的離心穩定性。取適量的甜菜色素微乳液，在3000r/min下離心30min觀察離心前后的乳液狀態。3）微乳液的儲藏穩定性。取適量的甜菜色素乳液在室溫下避光保存9d，保存期間每天觀察乳液的狀態。

1.3.4 微乳液對甜菜色素穩定性的影響

參照文獻[7]采用測定吸光值的方法測定微乳液水相中甜菜色素的含量，當pH為5時，甜菜色素乳液的最大吸收波長在530nm左右，因此以530nm處的吸光值表示甜菜色素的含量。1）標準曲線的繪制。用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L，pH5）分別配置質量分數為1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%（w/w）的甜菜色素水溶液和微乳液。在530nm處測定吸光值，根據測定結果繪制甜菜色素微乳液與水溶液的標準曲線。2）光照穩定性。移取5組質量分數為1.0%（w/w）的甜菜色素水溶液和微乳液，每個樣品5g，其中1組避光保存，其余4組放入恒溫光照培養箱中，光照強度15000lx，設定溫度為28℃，分別在第4h、8h、12h、16h取出1組樣品并避光保存。樣品全部取出后，用全波長酶標儀測定全部樣品在530nm處的吸光值，并根據各自的標準曲線計算甜菜色素的保留率。對比水溶液和微乳液中色素的保留率，判斷微乳液對甜菜色素光照穩定性的影響。3）熱穩定性。移取5組質量分數為1.0%（w/w）的甜菜色素水溶液和微乳液，每個樣品5g，其中1組常溫避光保存，其余4組放入電熱恒溫水槽中，設定溫度為60℃，分別在第30min、60min、90min、120min取出1組樣品并冷卻至常溫，用全波長酶標儀測定樣品在530nm處的吸光值，微乳液對色素熱穩定性的判斷方法同1.3.4（2）。

1.4 數據分析

所有試驗均重復3次并設置對照組，結果以平均值±標準偏差表示。數據結果采用Statistix 9.0軟件進行單因素方差分析，并采用最小顯著性差異法分析平均值之間的差異。

2 結果與分析

2.1 甜菜色素在不同pH下的呈色穩定性

分別用pH為3、5、7、9、11的緩沖溶液配置0.1%的甜菜色素溶液，室溫下避光放置60min后使用全波長酶標儀測定全波長掃描圖譜，得到的結果如圖1所示。

由圖1可知，當pH為3～7時，甜菜色素溶液的最大吸光值隨著pH的增大而增大，顏色由粉紅色變為深紅色，且吸光值下降可能是生成了新甜菜苷或異甜菜苷。當pH為5～7時，顏色和最大吸收的波長基本保持不變，說明甜菜色素在弱酸性下較穩定在530nm～540nm左右，這與張琳等[7]的測定結果一致。當pH為7～11時，甜菜色素溶液的最大吸光值隨著pH增大而減小，顏色由紅色轉變為紫紅色甚至紫色，可能是因為在堿性環境下甜菜紅素的穩定性較差，使甜菜紅素的總量減少，溶液呈現紫色[8]，而最大吸收波長隨著pH增大而增加，這與曹機良等[9]的測定結果相似。

綜上所述，pH為5時是甜菜色素溶液的最適pH。

2.2 甜菜色素微乳液制備方法的確定

2.2.1 混合乳化劑中司班80和吐溫80比例的確定

當司班80和吐溫80的比例為9∶1、8∶2、7∶3（HLB值為5.37～7.51）時，能夠形成微乳液的區域面積很小，無論葵花籽油和混合乳化劑的比例是多少，增溶的水相都沒有明顯的變化。當司班80和吐溫80的比例為6∶4（HLB值為8.58）時，有較大面積的微乳區域出現，且在混合乳化劑用量＜5g時，增溶水量隨著混合乳化劑用量的增加而增加。當司班80和吐溫80的比例到達5∶5（HLB值為9.65）時，微乳區域面積最大為16.2%，對應的葵花籽油和混合乳化劑的比例為5∶5。因此，選取司班80和吐溫80比例為5∶5進行后續單因素試驗。

2.2.2 助表面活性劑的選擇

根據上述結果，固定油相總質量為10g，司班80和吐溫80的比例為5∶5，分別設置無水乙醇和丙三醇兩種助表面活性劑的濃度為50%（w/w）。醇類的助表面活性劑能夠和乳化劑形成混合界面膜，同時提高界面膜的柔順性，使體系更容易形成微乳液并包裹更多的水相[10]。根據食品體系的原則，只研究葵花籽油與混合乳化劑的比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6的結果，2種助表面活性劑對臨界增溶水量影響的結果如圖2所示。

結果表明，當用無水乙醇作為助表面活性劑且混合乳化劑用量＞5g時，其對臨界增溶水量有提高的趨勢，推測其在混合乳化劑含量更高的體系中能有更好的表現，但這不符合食品體系選取的原則；用丙三醇作為助表面活性劑，當混合乳化劑用量≤5g時，臨界增溶水量隨著混合表面活性劑用量的增加而增加，當混合乳化劑用量＞5g時，臨界增溶水量開始有下降的趨勢。2種助表面活性劑展示出的不同趨勢表明不同的助表面活性劑對相同體系的助乳化效果不同。根據食品體系的原則，選擇在混合乳化劑含量較低時增溶效果最明顯的丙三醇作為最佳的助表面活性劑。

2.2.3 助表面活性劑濃度的確定

根據上述結果，固定油相總質量為10g，司班80和吐溫80的比例為5∶5，助表面活性劑為丙三醇，設置丙三醇在水相中的濃度分別為30%、40%、50%、60%（w/w）。不同濃度的丙三醇對臨界增溶水量的影響如圖3所示。

當丙三醇濃度低（30%、40%）時，臨界增溶水量隨著混合乳化劑用量的增加始終保持上升趨勢；當丙三醇濃度高（50%、60%）時，混合乳化劑用量＞5g后，臨界增溶水量隨濃度的升高出現明顯下降的趨勢。按照臨界增溶水質量分析可以得出，當混合乳化劑＜5g時，助乳化效果為60%＞50%＞40%＞30%；當混合乳化劑用量＞5g時，助乳化效果為50%＞40%＞30%＞60%。

在混合乳化劑與葵花籽油的比例為5∶5時，60%丙三醇的臨界增溶水相為2.15g，增溶水相中初始水相占比為總乳液的6.95%，而50%丙三醇的臨界增溶水相為1.93g，增溶水相中初始水相占比為總乳液的8.07%。研究目的是為了獲得能承載更多甜菜色素的乳液，而甜菜色素是溶于初始水相中，因此選取初始水相占比更大的50%丙三醇作為最佳助表面活性劑濃度。

2.2.4 甜菜色素最大添加量的確定

經測定，甜菜色素粉末在含有50%丙三醇的pH5磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中的最大溶解度約為20%（w/w）。根據上述結果，固定油相總質量為10g，司班80和吐溫80的比例為5∶5，助表面活性劑為50%的丙三醇，最大色素溶解度下的臨界增溶水質量為1.65g。此時微乳體系中水相占比14.2%，葵花籽油占比42.9%，混合乳化劑占比42.9%，最大色素含量約為1.42%。

2.3 甜菜色素微乳液的表征

由上述結果得出的甜菜色素微乳液最佳配方如下：混合乳化劑中司班80和吐溫80的比例用5∶5，葵花籽油和混合乳化劑的比例用5∶5，助表面活性劑選用50%丙三醇。以此配方配置1.0%（w/w）的甜菜色素乳液并用于后續甜菜色素微乳液的表征。

2.3.1 微乳液類型的鑒定

根據1.3.3中（1）的方法進行測定，亞甲基藍染劑在微乳液中因重力有些許移動、沒有擴散，可以認為制得的微乳液是W/O型乳液。

2.3.2 微乳液的離心穩定性

根據1.3.3中（2）的方法進行離心，通過離心前后對比可以得出，微乳液的外觀幾乎沒有任何變化，在經過高強度的離心后仍然保持澄清透明，無沉淀、無聚集、無渾濁、無分層，反映此微乳液體系的穩定性良好。

2.3.3 微乳液的儲藏穩定性

根據1.3.3中（3）的方法進行測定，微乳液在儲藏期間內始終保持澄清透明，無沉淀、無聚集、無渾濁、無分層，說明甜菜色素微乳液體系的儲藏穩定性良好。

2.4 微乳化對甜菜色素穩定性的影響

2.4.1 標準曲線的繪制

根據上述結果確定的最優微乳液配方，分別配置質量分數為1.0%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%（w/w）的甜菜色素微乳液和水溶液。在530nm處測定吸光值，根據測定結果繪制出甜菜色素微乳液與水溶液的標準曲線，結果如圖4所示。

使用Excel 2013對測定的數據進行擬合，甜菜色素微乳液和水溶液擬合的標準曲線R2均大于0.99，說明擬合效果好，微乳液和水溶液中甜菜色素含量與吸光值呈一定的線性關系。后續試驗可以使用此標準曲線將530nm處測得的吸光值換算為樣品中的甜菜色素的含量。

2.4.2 光照穩定性

將分別光照了0h（對照樣）、4h、8h、12h、16h的甜菜色素微乳液和水溶液在530nm處測定吸光值，之后通過2.4.1的標準曲線計算甜菜色素含量并換算成保留率。甜菜色素水溶液在經過16h自然光照射后，溶液的紅色略有變淡，甜菜色素的保留率在83%左右，這與其他學者研究得出的結果相似[10]。而甜菜色素微乳液在經過16h自然光照射后，色澤基本沒有發生變化，且仍然保持澄清透明，甜菜色素的保留率在90%以上，說明制成微乳液對甜菜色素的光照穩定性有一定的提升效果。

2.4.3 熱穩定性

將在60℃電熱恒溫水槽中保溫了0min（對照樣）、30min、60min、90min、120min的甜菜色素微乳液和水溶液在530nm處測定吸光值，并對數據做與2.4.2相同的處理。

甜菜色素水溶液在經過120min的保溫后，色澤發生明顯的變化，紅色變淡，甜菜色素保留率僅在61%左右。經過120min保溫的微乳液顏色也有明顯的變淡，但整體體系仍然保持澄清透明，甜菜色素保留率在77%左右，說明制成微乳液對甜菜色素的熱穩定性也有明顯提升。這與其他學者研究微乳化對花青素熱穩定性的提升有一定的相似性[11]。

3 結語

本文采用助表面活性劑濃度法制備微乳液并將甜菜色素包封在W/O型微乳液體系內，研究微乳液體系對甜菜色素穩定性的影響。結果表明，甜菜色素穩定性最佳的pH為5；甜菜色素微乳液的最佳制備配方為混合乳化劑中司班80、吐溫80的質量比為5∶5（HLB值為9.65），葵花籽油和混合乳化劑的質量比為5∶5，助表面活性劑選用50%的丙三醇溶液，初始水相使用pH為5的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液（0.05mol/L，pH5）。最終微乳體系中的水相占比14.2%，葵花籽油占比42.9%，混合乳化劑占比42.9%，最大承載的甜菜色素量約為1.42%。經鑒定甜菜色素微乳液為W/O型乳液，且具有良好的體系穩定性和光熱穩定性，研究結果為甜菜色素的穩定性方法的開發和應用提供了理論依據。

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