油橄欖體細胞胚發生和植株再生

摘要：[目的]以油橄欖的種胚為外植體，建立油橄欖‘Koroneiki'品種的體細胞胚發生及植株再生體系，旨在為油橄欖育種和遺傳轉化奠定基礎。[方法]將油橄欖種胚及后續不同發育階段的組織培養材料分別接種于愈傷組織誘導培養基、體細胞胚誘導培養基、成熟培養基、生芽培養基和植物生長培養基中，以誘導油橄欖體細胞胚和植株的再生，并對愈傷組織誘導率、體細胞胚誘導率和體細胞胚的成苗率進行統計。[結果]在添加0.5mg·L-1 2-iP和5mg·L-1BA的OM培養基中，‘Koroneiki’的種胚外植體誘導出愈傷組織，愈傷組織誘導率為98.72％，隨后將愈傷組織分離并轉移到添加0.5 mg·L-1 IBA的OM培養基中，成功誘導出體細胞胚，誘導率為8.50％。體細胞胚在其發育過程中經歷了球形胚、心形胚、魚雷胚以及子葉胚的階段。增殖培養基顯著增加了胚的生成數量，增幅達到普通培養基誘導體細胞胚的2.06倍。將成熟的子葉胚移至生芽培養基和植物生長培養基中，成功培育出油橄欖的再生苗，成苗率達到80.73％。將再生苗移植至溫室，經過2個月后能夠穩定存活。[結論]初步建立了我國主裁油橄欖品種‘Koroneiki’的體細胞胚間接發生體系，研究結果為油橄欖種苗的商業化生產和分子育種提供了理論和技術基礎。

關鍵詞：油橄欖；愈傷組織；組織培養；體細胞胚；植株再生

中圖分類號：S718.46；S565.7 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）06-0104-08

油橄欖（Olea europaea L）是一種重要的木本油料植物，廣泛分布于地中海地區。橄欖油是由油橄欖的果實榨取而成，被視為一種營養豐富的食用油。橄欖油不僅在地中海飲食中占有重要地位，而且在國際市場上也享有很高的聲譽。自1956年起，我國陸續引入并廣泛種植油橄欖，目前已在甘肅、四川、云南、湖北、浙江等多個省份形成大規模的栽培區域。在油橄欖的栽培過程中，傳統育種面臨著多方面的問題，其中包括幼苗期時間較長、低果實結實率以及種子發芽緩慢等難題。目前，許多生產國家為了增加果實產量、提高油成分含量和質量、縮短幼苗期以及應對害蟲和非生物脅迫等方面的挑戰，積極進行各項育種計劃。生物技術在這一過程中發揮著關鍵作用，采用遺傳轉化、基因編輯、多倍體誘導等手段，致力于實現新品種的改良，在這一技術體系中，植物單細胞的再生顯得尤為重要。

體細胞胚是指在體外環境下，植物體細胞經過脫分化和再分化的過程，形成類似于胚的結構。體細胞胚發生被廣泛運用于建立穩定、高效的植物再生體系，其在植物學和生物技術領域具有重要的研究和應用價值。體細胞胚經過特殊保存后還可被用來制作人工種子。近年來，林木體細胞胚的研究逐漸受到廣泛關注。據統計，至少20種不同的針葉樹，如從北美云杉（Picea sitchensis（Bongard） Carriere）、白冷杉（Abies concolor（Gordon） Lindl.ex Hildebr.）、黑松（Pinus thunbergil Parl.）和日本落葉松（Larix kaempferi（Lamb.） Carribre）等成功誘導了體細胞胚。在闊葉樹中，包括蘋果（Malus punlla Mill.）、西洋梨（Pyrus communis L.）和毛泡桐（Paulownia tomentosa Steud.）等20多個樹種的組織培養實驗中，體細胞胚成功發生并獲得了再生植株。體細胞胚發生體系具有遺傳穩定性好、接受外源DNA能力強、不易產生嵌合體等優勢，在多種植物的遺傳轉化體系中得到廣泛應用。研究人員已報道了蘋果、核桃（Juglans regiaL.）㈣、以及樟樹（Cinnamomum camphora （L.）J.Presl）等樹種的遺傳轉化體系。

目前我國尚未有關于油橄欖體細胞胚的研究報道。我國引入的‘Koroneiki’品種被認為是適合進行矮化密植、早熟高產的品種，該品種表現出強大的適應性，具備耐瘠薄、抗鹽堿、耐水分脅迫等特性。本研究以‘Koroneiki’品種的種胚為外植體成功誘導出了體細胞胚并獲得了再生植株，建立了油橄欖以體細胞胚發生方式獲得再生植株的技術體系，為進一步研究油橄欖人工種子、轉基因、基因編輯等育種技術提供了基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

4個油橄欖品種‘Arbequina’、‘Koroneiki'、‘Picual’和‘Leccino'的果實采摘自甘肅省隴南市武都區中國林科院實驗基地。收集成熟的油橄欖果實后，去除果肉，將帶殼的種子在室溫下晾干1個月后備用。

1.2試驗方法

1.2.1外植體的消毒 將油橄欖種子破殼并收集種仁，隨后進行充分沖洗，在自來水中浸泡48 h，以促使種仁軟化。在超凈工作臺環境下，使用75％乙醇溶液對種仁進行1 min的浸泡，然后用無菌水沖洗2次；接著使用10％次氯酸鈉溶液對種仁進行15 min的浸泡，再用無菌水沖洗5次；最后，使用無菌鑷子和手術刀在超凈工作臺內解剖出種仁中的胚，并將其切成碎片，為后續培養做準備。

1.2.2油橄欖愈傷組織的誘導 水解酪蛋白（Casein hydrolysate）對體細胞胚、不定芽的分化有良好的促進作用，在Cerezo等人的研究基礎上，對其實驗方案中的培養基進行了優化。以油橄欖專用培養基OM（PM1531，北京酷來搏科技有限公司）為基礎培養基，分別在愈傷組織誘導階段和體細胞胚誘導階段的培養基中額外加入了1 g·L-1的水解酪蛋白。首先，將油橄欖的種胚碎片接種到愈傷組織誘導培養基（OM+0.5 mg·L-12-iP（異戊烯腺嘌呤）+5 mg·L-1 IBA（3-吲哚丁酸）+ 30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂）上，并在23℃條件下采用暗培養方式。每個培養吼以一顆油橄欖種子為獨立實驗單位，確保每個培養皿上僅接種一顆種子的種胚碎片，并進行明確的標記。每組接種60顆種子，重復3次。在培養2周后統計愈傷組織的誘導率。愈傷誘導率的計算公式為Y=（n/N）x 100％，式中：y為愈傷誘導率，n為產生愈傷組織的外植體個數，N為接種外植體的總數。在培養26 d后將4個品種的種胚產生的愈傷組織放置在超景深體式顯微鏡（徠卡DVM6A）下，觀察其形態并進行拍照。

1.2.3油橄欖體細胞胚的誘導與增殖 在培養26 d后，對種胚碎片形成的愈傷組織進行分離，隨后將其轉移到體細胞胚誘導培養基（OM+0.5 mg·L-1 IBA+ 30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂）上以誘導體細胞胚的形成。每隔4周進行1次傳代，在23℃條件下采用暗培養方式。隨后，將誘導出體細胞胚的胚性愈傷組織團塊轉移到體細胞胚增殖培養基（ECO+ 0.1 mg.L-1 2-iP+ 0.1 mg·L-1 6-BA（6-芐氨基嘌呤）+0.05 mg·L-1 IBA+ 20 g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂，ECO基礎培養基成分：1/4OM基礎培養基大量元素、1/4 MS基礎培養基微量元素、1/2 0M基礎培養基維生素、50 mg·L-1肌醇和550 mg·L-1谷氨酰胺）上，以獲取更多數量的體細胞胚，培養條件同樣為23℃，暗培養。用體細胞胚誘導率（z）來評估誘導效果，其計算公式為z=（m/M）×100％，式中：m為產生體細胞胚的外植體數量，M為接種外植體的總數。最后，將誘導的體細胞胚放置在超景深體式顯微鏡下，觀察體細胞胚發生各個階段的形態并拍攝照片。

1.2.4油橄欖體細胞胚的成熟和植株再生 將誘導的體細胞胚從胚性愈傷組織中分離出來，然后轉移到成熟培養基（ECO+1 g·L-1 AC（活性炭）+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂）中，在23℃條件下采用暗培養方式。培養14 d后將成熟的胚轉移到生芽培養基（1/3 MS+ 10 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂）中，培養條件為23℃，光照強度為2 000 1x，光周期16 h·d-1。在20 d后，將再生小苗轉移到植物生長培養基（DKW+ 20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂）中，促進油橄欖的植株再生，培養條件為23℃，光照強度為2 000 Ix，光周期16 h·d-1。

1.2.5油橄欖再生植株的移栽 當無菌油橄欖小苗長到約8 cm高時，將培養瓶放在25℃室溫下，開蓋煉苗3d后，將幼苗從培養基中取出，隨后用緩慢的流水沖洗以清除根系附著的培養基，然后移栽到“腐殖土：珍珠巖=1：1”的基質土中。在接下來的4周內，保持遮蔭并維持85％左右的相對濕度，隨后逐漸降低濕度并增強光照強度。

1.2.6數據處理和統計 使用SPSS 26.0進行數據處理和分析，并利用Origin 2017繪制柱狀圖。

2結果

2.1油橄欖愈傷組織的誘導

將4個油橄欖品種的種胚接種至愈傷組織誘導培養基上，培養26 d后分別觀察到了不同的愈傷組織形態（圖1），表1統計了4個品種的愈傷組織誘導率和生長狀態。其中，‘Koroneiki’品種的愈傷組織偏嫩黃色，表面有許多細小顆粒（圖1D），其愈傷組織誘導率最高，為98.72％，‘Leccino’品種的愈傷組織偏黃色，表面呈水漬狀（圖1C），愈傷組織誘導率最低，為76.84％。

2.2油橄欖體細胞胚的誘導與增殖

將誘導的愈傷組織分離后，轉移到體細胞胚誘導培養基上，經過31d首次觀察到了球形胚形態（圖2A），隨后的培養過程中依次觀察到了心形胚形態（圖2B）、魚雷胚形態（圖2C）和子葉胚形態（圖2D）。表1統計了‘Koroneiki’品種和‘Leccino’品種的體細胞胚誘導率和成苗率，其中，‘Koroneiki’的體細胞胚誘導率為8.50％，‘Leccino’的體細胞胚誘導率為1.79％，其余兩個品種在誘導階段均未觀察到體細胞胚的發生。

將胚性愈傷組織和胚性團塊轉移到體細胞胚增殖培養基中，經過1個月后觀察到更多數量的體細胞胚（圖3C）。胚性物質在普通體細胞胚誘導培養基里的誘導率為170.2％，然而，胚性物質在體細胞胚增殖培養基里的誘導效率為350.5％，其數量是普通誘導數量的2.06倍（圖3D），體細胞胚增殖培養基成功實現了油橄欖體細胞胚的數量增殖。

2.3油橄欖體細胞胚的成熟及植株再生

將獲得的體細胞胚轉移到成熟培養基中，經過2周，可觀察到體細胞胚明顯變大，胚軸變粗、子葉更加明顯（圖4A），此時，將成熟變大的成熟胚轉移到生芽培養基并置于光下，20 d后，觀察到第一對葉片和第二對葉片的出現，同時一些小苗伴隨著細小的根的出現（圖4C），在該階段，體細胞胚的成苗率為80.73％（表1）。將再生小苗轉移到植物生長培養基中促使其生根和生長，2周后，觀察到根的出現和芽的伸長（圖4D），待再生苗長至5～8 cm高時，移植到腐殖土：珍珠巖=1：1的基質土中，可以穩定成活（圖4E）。

3討論

本研究成功建立了油橄欖體細胞胚發生和植株再生體系。4個油橄欖品種在本研究中均成功誘導出愈傷組織，其中‘Koroneiki'品種的愈傷組織誘導率最高，達到了98.72％。體細胞胚的發生關鍵在于胚性愈傷組織的有效誘導。胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織在形態學和組織細胞學結構上存在顯著差異。通過對愈傷組織的形態學觀察發現，鹽膚木（Rhus chinensis Mill.）的非胚性愈傷組織呈水漬狀、質地偏軟且疏松，而胚性愈傷組織呈黃褐色、質地較緊密。葡萄風信子（Muscari botryoides Mill.）的非胚性愈傷組織為白色松散狀，而胚性愈傷組織則呈淡黃色緊實狀。對普通油茶（Camellia oleifera Abel）的愈傷組織進行細胞學觀察時發現非胚性愈傷組織中的細胞染色淺，細胞大而內含物較少，未見明顯的細胞核，而胚性細胞較小且內含物豐富，可見明顯的細胞核。在誘導油橄欖愈傷組織的過程中，本研究觀察到了具有‘黃色、質地緊密且表面有細小顆粒狀’特征的愈傷組織（圖1D），并且后期觀察到了這類形態的愈傷組織產生了體細胞胚，因此推斷這類形態的愈傷組織為油橄欖的胚性愈傷組織。

體細胞胚的生成可以通過兩種途徑進行，一種是直接方式，另一種是間接方式。直接體細胞胚發生過程中，植物外植體細胞直接分化為體細胞胚，無需經過愈傷組織階段；而間接體細胞胚發生則首先形成胚性愈傷組織，進而分化成體細胞胚。‘鳳丹’牡丹（Paeonia suffruticosa ‘Feng Dan’）、地被菊‘玉人面’（Chrysanthemum morifolium‘Yurenmian’）和香雪蘭（Freesia refracta Klatt）等可以通過直接發生方式形成體細胞胚，而日本落葉松、核桃和蘋果等木本植物通過間接發生方式形成體細胞胚。在本研究中，四個油橄欖品種中僅有‘Koroneiki’和‘Leccino’成功誘導出了體細胞胚，其中‘Koroneiki’的誘導率為8.50％，且能夠成功發育成完整植株（圖4），成苗率為80.73％，而‘Leccino’的誘導率僅有1.79％，未能成功發育成完整植株，兩個品種的體細胞胚發生方式均為間接發生。

植物體細胞胚研究一直關注的核心難題是增殖效率，這也是評估體細胞胚發生體系合格性的重要指標。適當的外源激素可以有效地提升胚性物質的增殖率，增加成熟子葉胚的產量。在對日本落葉松體細胞胚發生的研究中，發現2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、6-BA和ABA（脫落酸）顯著影響體細胞胚的發生能力。各激素不同濃度的配比也明顯影響著體細胞胚的誘導效果。在對鹽膚術體細胞胚的研究中，探究了6-BA和NAA（萘乙酸）兩種激素配比對體細胞胚誘導的影響，最終發現，只有當6-BA濃度為2mg·L-1、NAA濃度為0.5 mg·L-1，且兩者的比例為4時才能誘導出體細胞胚。本研究的結果顯示，將胚性物質轉入普通體細胞胚誘導培養基里的誘導效率為170.2％（圖3D），結合先前研究，使用了含0.1 mg·L-1 2-iP、0.1 mg·L-16-BA和0.05 mg·L-1 IBA的ECO培養基處理油橄欖胚性物質，增殖效率可以提高至350.5％（圖3D），這種增殖培養基對油橄欖體細胞胚的后續傳代和增殖具有重要意義。愈傷組織細胞懸浮培養的優點包括高度分散、均勻生長、快速增殖、可重復性強、易于控制、維持較高細胞全能性，以及提高植株再生率等。黑鵝絨海芋（Alocasia reginula A.Hay）、巴西橡膠樹（Hevea brasdiensis （Willd.ex A Juss.） Mull.Arg.）及野生阿寬蕉（Musa itinerans Cheesm.）等植物通過建立胚性愈傷組織的懸浮體系獲得了更高效的體細胞胚的再生體系。本研究后續可以通過建立胚性愈傷組織懸浮體系來優化體細胞胚的增殖體系。

4結論

本研究以油橄欖種胚為外植體，成功建立了‘Koroneiki’品種的體細胞胚間接發生體系，并展現了較強的組織再生能力。在該體系中，愈傷組織的誘導率高達98.72％，并通過將愈傷組織轉移到體細胞胚誘導培養基，成功誘導體細胞胚的形成，誘導率為8.50％。體細胞胚增殖培養基顯著提高了體細胞胚的形成數量，增幅為普通培養基的2.06倍。在生芽培養基和植物生長培養基中成功培育出油橄欖的再生苗，成茁率達80.73％。未來，在這一體系的基礎上利用先進的遺傳轉化技術，有望能夠精準地導入和調控目標基因，以實現對特定性狀的精準改良。這一體系的建立為油橄欖的高效育種和遺傳轉化提供了理論和技術支持，為油橄欖種苗的商業化生產和分子育種奠定了基礎。