ε-聚賴氨酸對蘋果采后灰霉病防治效果及機理

摘要：為探尋高效、安全的蘋果采后灰霉病的控制方法，研究 ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）對蘋果采后灰霉病的防治效果及其抗性誘導機制，以無菌水為對照，采用不同濃度的 ε-PL誘導處理蘋果24 h后，探究 ε-PL 控制蘋果灰霉病的最佳使用濃度。將 ε-PL分別用打孔注入和整果浸泡的方法處理蘋果，研究其對蘋果抗性物質分泌、抗性酶活性及其編碼基因表達的誘導機制，同時考察其對蘋果自然腐爛和貯藏品質的影響。結果表明，400 mg/L 的ε-PL防治蘋果采后灰霉病的效果最佳，其能誘導蘋果酚類化合物、類黃酮和木質素含量顯著升高（Plt;0.05），同時能誘導提高多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）編碼基因的表達，提高抗性酶活性。此外，該濃度 ε-PL浸果處理0.25 h貯藏50 d后，蘋果的自然腐爛率相對于對照組降低了77.26%，貯藏品質相比對照組更好。因此，ε-PL能有效控制蘋果采后灰霉病，具有較高的應用價值。

關鍵詞：ε-PL；生理機制；灰霉病；蘋果；誘導抗性；防治效果

中圖分類號：TS255.3" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0187-07

竇" 勇，閭懷中，孔令偉，等. ε-聚賴氨酸對蘋果采后灰霉病防治效果及機理［J］. 江蘇農業科學，2024，52（23）：187-194.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.026

收稿日期：2024-05-26

基金項目：2024年江蘇高校“青藍工程”中青年學術帶頭人項目。

作者簡介：竇" 勇（1979—），安徽巢湖人，博士，副教授，研究方向為果蔬采后保鮮技術。E-mail：douyong1979@163.com。

蘋果含有豐富的維生素和膳食纖維，是人們喜愛的水果之一。在貯藏和運輸過程中，蘋果易受損傷而被霉菌侵染。由灰霉（Borytis cinerea）引起的灰霉病是蘋果的采后主要病害之一，采用化學防腐劑來控制灰霉病，效果雖好，但存在環境污染和食品安全問題［1］。為此，研發安全性高的蘋果灰霉病控制方法，市場前景廣闊［1］。ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是一種無毒防腐劑，具有較強的抗菌效力，其作為一種天然的食品保鮮劑，已廣泛應用于面包、飲料等食品［2］。近年來，ε-PL在水果采后病害防治領域的研究也已有開展。Sun等的研究發現 ε-PL能提高龍眼ATP酶活性，增加ATP、ADP含量和能荷水平，進而提高龍眼的抗病能力［3］。Shu等研究結果表明，ε-PL對蘋果、冬棗和番茄的采后黑斑病的防治效果顯著［4］。Jiao等報道了ε-PL能顯著抑制草莓、櫻桃番茄、葡萄和青椒灰霉病的發生。此外，有研究發現 ε-PL可以作為一種生物源性化學激發子來誘導提高水果對采后病害的抗病能力［5］。Liu等研究發現 ε-PL處理能誘導煙草苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）等抗性酶活性的提高，增強煙草的抗病毒能力［6］。Sun等的研究結果表明，ε-PL處理能誘導抗病物質（木質素和H2O2）含量和多酚氧化酶（PPO）、PAL、POD等抗病酶活性的提高［7］。Li等在研究 ε-PL對冬棗灰霉病的防治效果中，發現 ε-PL能誘導呼吸爆發氧化酶同源物編碼基因RBOH的上調表達，產生活性氧（ROS）來抑制冬棗中灰霉菌的生長［8］。

然而，ε-PL在蘋果采后病害的防治中的應用研究較少，特別是在 ε-PL控制蘋果采后灰霉病及其機制方面的研究較少。為探索安全、高效的蘋果采后灰霉病的防治方法，本研究通過打孔和整果浸泡的方法，用 ε-PL誘導處理蘋果，探究其對灰霉病和自然腐爛的防治效果及機理，并考察其對蘋果品質指標的影響，以期為蘋果采后灰霉病的防治提供試驗參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗時間與地點

于2023年5月1日至9月30日，在江蘇財經職業技術學院糧食與食品藥品學院微生物實驗室進行試驗。

1.2" 材料與試劑

1.2.1" 供試水果

商品熟的紅富士蘋果采自山東煙臺某果園，選擇未經化學處理，大小基本一致，無病蟲害，未受機械損傷的果實作為供試蘋果。用0.1%（體積比）次氯酸鈉浸洗120 s，再用無菌水清洗殘留表皮的氯酸鈉和微生物后，晾干備用。

1.2.2" 供試病原菌

從自然發病的蘋果上分離、純化1株病原菌，經鑒定為B.cinerea，為蘋果的致病菌。將B.cinerea孢子接種于馬鈴薯葡萄糖（PDB）培養基中，于25 ℃培養1 d，再將孢子懸液涂布接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養上，于25 ℃繼續培養7 d，進行菌種活化。用無菌鋼制角匙輕刮表面孢子，加入無菌水后再用移液器吸取孢子懸液經4層無菌紗布過濾，用血球計數板法測定孢子濃度，并用無菌水調節孢子懸浮液濃度至1×105個/mL，備用［9］。

1.2.3" 主要試劑

戊二醛、乙二胺四乙酸（EDTA）、愈創木酚、苯丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），分析純，淮安市科密化學試劑有限公司；ε-PL，化學純，美國Sigma公司。PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒，大連TaKaRa公司。

1.3" 主要儀器與設備

D-50型移液器，德國BRAND公司；CFX96型熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司（ABI）；JIDI-16R型冷凍離心機，廣州吉迪儀器有限公司；JSF-7001型熱場發射掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；LHP-400型恒溫恒濕培養箱，常州普天儀器制造有限公司；HT-1112M型立式恒溫搖床，上海赫田科學儀器有限公司；TA-XT2i型物性測試儀，英國Stable Micro System公司。

1.4" 試驗方法

1.4.1" ε-PL對蘋果灰霉病的防治效果

用打孔器在蘋果中央均勻打孔4個，大小為5 mm×4 mm，處理組每孔分別注入25 μL的ε-PL（濃度分別為100、200、400、800、1 000 mg/L），以無菌水為對照（CK），將所有供試蘋果置于無菌框中，用聚乙烯（PE）膜密封，于室溫、相對濕度（RH）95%條件下貯存 24 h［1］。所有供試蘋果每孔接種25 μL的 1×105個/mL 的B.cinerea孢子懸浮液，于相同條件下貯存［10］。從第3天開始，每隔1 d，采用十字交叉法測定傷口腐爛直徑，并統計腐爛率。

1.4.2" ε-PL在蘋果體內對B.cinerea菌絲生長的影響

按照“1.4.1”節中方法處理供試蘋果，每孔注入25 μL的400 mg/L的 ε-PL，以無菌水為對照，于RH 95%、室溫下貯存24 h。所有供試蘋果每孔注入25 μL 1×105 個/mL的B.cinerea孢子懸液，相同條件下繼續貯存［1］ 。分別在接種后的8、14、20 h 取樣，制備掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，簡稱SEM）樣品。用經火焰滅菌并冷卻后的手術刀削取傷口孔內圈厚約1 mm的組織，用2.5%的戊二醛浸泡，避光5 h，再將組織薄片浸沒在0.1 moL/L（pH值=7.2）的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，簡稱PBS）中5次，每次 30 s。依次用30%、60%、90%、100%的乙醇溶液浸洗，每次6 min［1，11-12］。處理好的蘋果切片經真空冷凍干燥20 h后，固定于SEM樣品臺上，在SEM下觀察B.cinerea在蘋果體內的生長情況。

1.4.3 ""ε-PL對蘋果抗性相關酶活性的影響

試驗設置CK組和處理組，采用“1.4.2”節中的方法處理供試蘋果，CK組經無菌水處理后接種B.cinerea孢子，處理組經 ε-PL處理后接種B.cinerea孢子。分別于試驗當天和隨后每隔1 d取樣，用無菌手術刀削取傷口處組織薄片2 g，于事先滅菌并冷凍的研缽中，加入約2 g石英砂和1 mL含0.038% EDTA和1% PVP的50 mmol/L（pH值為7.8）的PBS溶液，充分研磨后加入9 mL PBS，將所有組織轉入無菌離心管中，于 0 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，用于測定酶活性，以U/g 鮮重（fresh weight，簡稱FW）表示［1，13］。PPO活性測定參考Godana等的方法，略作修改，酶活定義為D398 nm每分鐘增加0.01為1個酶活單位（U）［1，14］。PAL活性的測定參考Xi等的方法，稍作改動，酶活定義為D290 nm每小時增加0.01為 1 U［15］。POD活性的測定參照Godana等的方法，略作改動，酶活定義為D470 nm每分鐘增加0.01為 1 U［16］。CAT活性的測定參考Zhou等的方法，稍作調整，酶活定義為D420 nm每分鐘降低0.01為1 U［17］。

1.4.4" 蘋果抗性相關酶編碼基因表達量的測定

采用“1.4.3”節中使用的蘋果組織樣品約2 g，于事先滅菌并冷凍的研缽中，立刻倒入液氮，快速磨成粉末，分別用試劑盒提取總RNA，并對RNA進行反轉錄。參考Dou等的方法，測定蘋果抗性酶編碼基因相對表達量［2，18］。用Primer Premier 5.0軟件設計蘋果抗性相關酶編碼基因的RT-qPCR特異性引物，見表1。

1.4.5" "ε-PL對蘋果抗性物質分泌的影響

采用“1.4.3”節中使用的蘋果組織樣品，測定蘋果抗性物質含量。參照Deng等的方法，測定蘋果總酚和類黃酮的含量，分別用D280 nm /g FW和D325 nm /g FW表示［19］。參考Morrison等的方法，測定蘋果木質素的

含量，用D280 nm /g FW表示［20］。

1.4.6 ""ε-PL對蘋果采后自然腐爛和貯藏品質的影響

選擇未經化學處理，大小基本一致，無病蟲害，未受機械損傷的蘋果，用400 mg/L" ε-PL溶液浸泡蘋果0.25 h，以無菌水為對照。隨后，置于無菌塑料框中密封，于RH 95%、室溫下貯藏50 d。然后，統計腐爛率并測定貯藏品質指標。參照彭貞貞等的方法，測定蘋果的可滴定酸（titrable acidity，簡稱TA）含量［21］；參照Semyalo等的方法，測定蘋果的可溶性固形物（soluble solid content，簡稱SSC）含量［22］；參照Tokala等的方法，使用物性儀測定蘋果的硬度［23］；參照Wang等的方法，測定蘋果的維生素C含量［24］；失重率參照Li等的方法［25］進行測定。

2" 結果與分析

2.1" ε-PL對蘋果灰霉病的控制效果

圖1是蘋果經不同濃度 ε-PL處理24 h后，接種灰霉菌孢子，貯存6 d的腐爛情況。可以看出，當ε-PL濃度在100～800 mg/L時，能夠有效地抑制灰霉菌引起的腐爛，其中400 mg/L處理組蘋果的腐爛率和腐爛直徑顯著低于其他試驗組（Plt;0.05）。ε-PL濃度升到800 mg/L時，蘋果傷口腐爛率和腐爛直徑開始增大；濃度升到1 000 mg/L時，腐爛率和貯藏4 d的腐爛直徑與CK組相比差異不顯著（Pgt;0.05）。這說明，400 mg/L的 ε-PL對蘋果灰霉病的抑制效果最佳，過高的濃度可能引起蘋果自身組織細胞的損傷，反而加速傷口腐爛進程，不利于 ε-PL控制蘋果采后灰霉病。

2.2" ε-PL對蘋果自然腐爛和貯藏品質的影響

用400 mg/L的 ε-PL對蘋果浸果處理 0.25 h，于20 ℃、RH 95%條件下貯藏50 d，考察蘋果腐爛情況及品質指標。如表2所示，處理組自然腐爛率顯著低于CK組， 相較于CK， 蘋果自然腐爛率降低了77.26%；失重率降低了17.75%；相反，硬度提高了10.22%。與CK相比，處理組的TA、SSC、

維生素C含量的差異均不顯著。可見，400 mg/L的 ε-PL防止蘋果自然腐爛效果顯著，且能提高蘋果的貯藏品質。

2.3" ε-PL在蘋果體內對B.cinerea菌絲生長的抑制效果

蘋果經400 mg/L的 ε-PL處理后再接種B.cinerea孢子，其菌絲生長情況見圖2。CK組B. cinerea 在接種后的8 h內孢子均未萌發，14 h后孢子已萌發且出現明顯的菌絲生長，20 h后菌絲已布滿蘋果組織表面。從CK組SEM圖可以看出，在接種14 h后，蘋果組織變得粗糙，代謝物增多，B. cinerea 孢子能正常生長并侵染未經 ε-PL處理的蘋果組織。處理組SEM圖顯示，B.cinerea孢子在接種后的20 h內均未萌發，孢子干癟，蘋果組織表面較為完整，未見明顯代謝物。可見，在蘋果體內，400 mg/L 的 ε-PL對B.cinerea菌絲生長控制效果明顯。

2.4" ε-PL對蘋果抗性物質分泌的影響

2.4.1" ε-PL對蘋果總酚含量的影響

酚類物質是水果抵御真菌侵染的重要的抗病物質，在苯丙烷代謝途徑中合成，該途徑受到PAL和POD活性的調控［1，25］。由圖3可知，從1 d起，處理組的總酚含量顯著高于CK（Plt;0.05），其中在3 d時總酚含量最高，在隨后的4～7 d，維持著較高的水平。可以看出，ε-PL能誘導蘋果酚類物質的分泌，來提高其對灰霉病的抗病力。

2.4.2" ε-PL對蘋果類黃酮含量的影響

類黃酮包括查爾酮、根皮苷、高圣草素和表兒茶素等物質，它是水果體內一類重要的抗菌物質，當水果受到病原菌侵染時，會釋放此類物質，來抵御外來脅迫作用。由圖4可知，ε-PL處理組蘋果類黃酮含量在貯藏的1～3 d不斷上升，在3～7 d 維持著較高的水

平，且從2 d開始，處理組蘋果類黃酮含量均顯著高于CK組（Plt;0.05），這說明 ε-PL處理能誘導提高蘋果抗菌物質類黃酮的含量。

2.4.3" ε-PL對蘋果木質素含量的影響

木質素是構成水果細胞壁的主要成分， 為細胞壁纖維素骨

架的填充物，它能提高細胞壁機械強度，加速組織木質化，來抵御外來脅迫作用［1，26］。從圖5可以看出，在貯藏的2～5 d，經 ε-PL處理的蘋果木質素含量維持較高水平，其中2 d時含量最高，5 d后含量開始下降。由此可見，ε-PL能誘導蘋果木質素分泌，提高細胞壁強度，增強其對灰霉病的抗病力。

2.5" ε-PL對蘋果抗性酶活性及其編碼基因表達的影響

2.5.1" ε-PL對蘋果PPO活性及其編碼基因表達的影響

PPO能催化水果組織中多酚物質氧化成醌，醌類物質可以形成含棕黑素的痂來保護自身組織細胞，在水果抗病中發揮著重要作用［27-28］。圖 6-A 顯示，ε-PL處理組蘋果的PPO活性顯著高于CK，且在貯藏的3～5 d其活性處于較高的水平，6 d時開始，活性下降。同樣，圖6-B顯示其編碼基因PPO相對表達量呈現相應的變化趨勢。

2.5.2" ε-PL對蘋果PAL活性及其編碼基因表達的影響

PAL是水果苯丙素合成過程中首步反應的關鍵限速酶，其活性直接影響蘋果酚類化合物等抗性物質的合成。由圖7-A可知，隨著貯藏時間的延長，PAL活性不斷升高，在貯藏4 d時達到峰值103.59 U/g FW，隨后開始下降；從2 d開始，經 ε-PL 誘導處理的蘋果PAL活性顯著高于CK。從

圖 7-B 可以看出，從1 d開始PAL的編碼基因PAL的相對表達量均高于CK，在4 d時達到最大值，是CK組的5.34倍。

2.5.3" ε-PL對蘋果POD活性及其編碼基因表達的影響

POD是水果主要抗氧化防御酶之一，它能有效清除水果因外來病原菌侵染而釋放過量的ROS，其參與催化苯丙烷代謝途徑中木質素的生物合成，進而增加細胞壁強度［29］。從圖8-A可以看出，處理組POD活性在貯藏的2～7 d內均顯著高于CK，且隨著貯藏時間延長，活性不斷上升，在5 d時達到峰值104.36 U/g FW，隨后開始降低。由圖 8-B 可知，POD相對表達量從貯藏的1 d開始不斷增大，到5 d時達到峰值，為CK組的3.98倍，隨后開始下降。

2.5.4" ε-PL對蘋果CAT活性及其編碼基因表達的影響

CAT是水果體內重要的ROS清除酶，它能夠有效清除體內過量的H2O2，保護細胞免受氧化損傷，其在維持水果體內ROS穩態發揮著重要作用［30］。由圖9-A可知，ε-PL處理組蘋果的CAT活性在貯藏的1～7 d內均顯著高于CK組，且在2、3、5 d時CAT活性較高，分別達到7.7、 7.9、 8.4 U/g FW。而從圖9-B可以看出，在貯藏1～7 d時處理組CAT表達量高于CK，且2、3、5 d的CAT相對表達量也較

高，分別是CK組的3.17、3.20、3.78倍。

3" 討論與結論

400 mg/L的 ε-PL能有效控制蘋果采后灰霉病，濃度低于100 mg/L的 ε-PL無法控制蘋果采后灰霉病，高于800 mg/L的 ε-PL控制效果減弱，過高的 ε-PL濃度可能引起蘋果自身組織細胞的損傷，加速腐爛進程，反而不能控制由灰霉病引起的蘋果腐爛。400 mg/L的 ε-PL浸泡處理蘋果 15 min，能有效抑制蘋果的自然腐爛，并提高蘋果的貯藏品質，這一研究成果將有助于 ε-PL作為一種安全的食品防腐劑應用于蘋果和其他水果采后病害防治和貯藏保鮮領域。ε-PL在蘋果體內能有效抑制B.cinerea孢子萌發和菌絲生長，與 ε-PL自身抑菌效力和其誘導蘋果釋放抗性酶和抗性物質有關。ε-PL 能誘導蘋果抗性物質的合成，增強其對灰霉病的抗病能力，如能誘導抗性酶編碼基因PPO、PAL、POD和CAT的上調表達，提高抗性酶PPO、PAL、POD和CAT的活性；ε-PL能誘導蘋果分泌抗菌物質酚類化合物、類黃酮和木質素。本研究從生理角度探討了ε-PL控制蘋果采后灰霉病的抗性誘導機制，但在分子層面的研究不夠深入，后續將開展 ε-PL對蘋果抗性基因表達和對 B. cinerea 侵染基因表達的影響等分子層面的研究。

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