結核感染T細胞斑點實驗，新技術快速診斷結核病

【摘要】相信大家對于結核病都不陌生，它是一種以結核分枝桿菌為病原體的慢性傳染病，以肺部結核感染最為常見，可侵及多個臟器。排菌者為其重要的傳染源，通過把含有結核菌的微粒排到空氣中形成飛沫傳播。結核感染T細胞斑點實驗（T-SPOT.TB）是檢測結核的新技術，近年，很多醫院采用T-SPOT.TB對結核感染進行篩查，現對該技術進行簡要介紹。

【關鍵詞】結核；T細胞斑點實驗

【中圖分類號】R52 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.22.0145.02

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.22.048

結核感染T細胞斑點實驗（T-SPOT.TB）被用于結核感染檢測、肺結核/肺外結核診斷與鑒別診斷，具有以下獨特優勢：首先，特異性好。僅對結核分枝桿菌復合群敏感，而對絕大多數環境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應。其次，靈敏度高。基本不受免疫功能低下的影響，在肺外結核患者中檢出率較高。最后，操作簡便、結果快速。只需簡單的血液檢測，24 h內就可以得到報告結果。

1 T-SPOT.TB檢測的適應證

T-SPOT.TB主要針對結核分枝桿菌潛伏感染和活動性結核病的輔助診斷。

T-SPOT.TB在活動性結核病輔助診斷中的應用：肺結核診斷以病原學、病理學結果為確診依據。對于缺少細菌學診斷依據（如痰培養陰性）的活動性結核病的患者，T-SPOT.TB可起到補充或輔助診斷的作用。出現腹腔積液或胸腔積液的患者，可采用體液或組織標本來補充或輔助診斷結核性胸膜炎或結核性腹膜炎。

T-SPOT.TB在結核潛伏感染輔助診斷中的應用：結核潛伏感染（LTBI）指的是一種機體對結核分枝桿菌（MTB）抗原刺激產生持續的免疫應答，但無明顯活動性結核病臨床表現的狀態。在實際臨床中，感染者往往沒有結核病的任何癥狀和體征，痰液等標本的抗酸染色涂片和培養均為陰性，影像學檢查也正常。LTBI不具有傳染性，但機體免疫狀態發生改變后可進展為活動性結核病。而在某些情況下，MTB可以一直呈潛伏感染而不發病，長期處于休眠狀態，但其仍具備重新致病的能力，其是否進展為活動性結核病與患者機體的免疫狀態密切相關。

2 T-SPOT.TB的檢測原理

結核分枝桿菌感染的免疫應答反應以細胞免疫為主，感染者的T細胞受結核抗原刺激致敏，形成活化的效應T細胞。T-SPOT.TB運用γ-干擾素釋放試驗（IGRA）技術，檢測被結核分枝桿菌特異的早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培養濾液蛋白10（CFP10），分別刺激全血中的T細胞。結核感染者及既往感染者血液中的T細胞再次接收到抗原刺激，會迅速形成效應T細胞，并分泌γ-干擾素。通過酶聯免疫斑點技術（ELISPOT），分泌的γ-干擾素被預包在反應孔膜上的特異抗體捕獲，將可溶的底物溶液加入每個檢測孔中，在反應部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑點。每一個斑點代表一個分泌γ-干擾素的T細胞，計數斑點數量可以獲得外周血中結核致敏的T細胞數量。通過檢測結核致敏的T細胞數量，輔助診斷結核感染。

3 T-SPOT.TB結果判讀

T-SPOT.TB實驗設有陰性對照孔、以植物血凝素（PHA）作為刺激原的陽性對照孔及ESAT-6和CFP10作為刺激原的兩個實驗孔A和B；實驗結果用每25萬個外周血單個核細胞中斑點形成細胞（SFCs）的數目來判斷陰陽性結果：一般來說，在手工放大鏡、4倍物鏡顯微鏡或USB電子放大鏡下觀察到結合在底膜上的紫色點，中間色深、周圍有淺色暈的點才是實驗結果的斑點；斑點計數儀是根據斑點顏色飽和度、直徑大小和顏色梯度進行斑點的判讀。根據抗原A孔或抗原B孔的斑點數判讀結果：當空白對照孔斑點數為0～5個時且（抗原A孔或抗原B孔班點數）減去（空白對照孔班點數）≥6，為“陽性”。當空白對照孔斑點數為6～10個時且（抗原A孔或抗原B孔斑點數）≥2X（空白對照孔班點數），為“陽性”。如不符合上述標準，且陽性對照孔正常時檢測結果為“陰性”。無效結果：當陰性對照孔斑點數>10個或當陽性對照孔斑點數<20個時為“不確定”結果，需要復查。陰性對照孔和陽性對照孔具有指示整體實驗情況是否正常的作用。如果一批結果陰性對照孔有較多斑點，很有可能實驗過程中存在污染；如果一批結果陽性對照孔沒有斑點或斑點較少，那需要懷疑細胞整體反應是否異常或者第2天是否出現操作失誤等。“灰區”：當陰性對照孔斑點數為0～5個并且A或B斑點數減去陰性對照孔斑點數等于5～7個時，此結果被認為是“灰區”。如果得到“灰區”結果，不能認為是“不確定”結果，也就是說處在5、6、7個斑點的結果仍然是有效的結果，應該按照我們的“結果判讀標準”來確定“陰性”或“陽性”。應當利用所有可利用的相關臨床信息進行判斷，并跟其主治醫師進行溝通后再報結果，必要時進行復查。

陽性對照孔和陰性對照孔作為T-SPOT.TB實驗的質控，是判斷實驗結果是否有效的標準，每個患者都須做陰性對照孔和陽性對照孔。陽性對照孔具有正常反應性，說明參與反應的細胞有正常的免疫功能，大部分人群對植物血凝素都有反應，可能會存在少數人群對植物血凝素不敏感導致陽性對照孔沒有反應或反應弱。陰性對照孔正常則說明參與反應的細胞在沒有外界刺激下是一個穩定的狀態，不會有任何免疫應答反應，大部分人群陰性對照孔不會出斑點，也同樣存在少數人在沒有外界刺激的情況下細胞有反應而釋放γ-干擾素，導致陰性孔出現較多斑點。

4 T-SPOT.TB的臨床意義

4.1 陽性結果

首先，臨床有典型結核癥狀，影像學等檢查支持結核病，且臨床排除其他疾病，陽性結果支持活動性結核病。其次，臨床有典型結核癥狀，但檢查手段未發現結核患病證據，且排除其他疾病，陽性結果支持結核分枝桿菌感染診斷，建議試驗性抗結核治療。再次，臨床無結核癥狀及其他結核患病證據，陽性結果臨床診斷為潛伏性結核感染（LBTI），根據風險程度決定是否用藥。最后，既往有結核病史或明確結核病證據，無結核癥狀，陽性表明曾患過結核病，不代表目前有活動性結核病。

4.2 陰性結果

首先，陰性結果代表目前機體沒有結核分枝桿菌特異抗原致敏的T淋巴細胞，即目前未感染結核分枝桿菌。臨床診斷上首先排除結核病。其次，有假陰性可能，如窗口期、免疫功能不全（HlV感染者）、特殊肺外結核（結腦）、實驗非正常操作。