恩諾沙星片含量均勻度測(cè)定方法的建立

【摘要】目的：為了建立恩諾沙星片中恩諾沙星含量均勻度的測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，以0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0）-乙腈（83∶17）為流動(dòng)相，色譜柱為Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流速為1.0 mL/ min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；進(jìn)樣體積為10μL。結(jié)果：恩諾沙星的峰面積積分值在20.50～102.52μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r=0.9999），平均回收率達(dá)到99.9%，RSD=0.4%，含量均勻度的平均值（A+2.2S）分別為98.4%（5.2）、93.2%（11.0）、95.5%（10.1）、107.1%（14.8）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，適用于恩諾沙星片含量均勻度的測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】恩諾沙星片；含量均勻度；高效液相色譜法

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.005

Establishment of Test for Content Uniformity in Enrofloxacin Tablets

HAN Chunxiao， GAO Hongqian， XU Bin， XU Lijia， LI Yan

（Liaoning Inspection ，Examination&Certification〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China）

Abstract： Objective： To establish the method for content uniformity of compound enrofloxacin tablets. Method： The mobile phase is 0.025 mol / L phosphoric acid solution （adjust pH to 3.0 with triethylamine） - acetonitrile （83∶17）， the HPLC column is Waters Xbridge？C18 column （250 mm×4.6 mm）， the flow rate is 1.0 mL/min， the column temperature is 35℃， the detection wavelength at 278 nm， and injection volumes are 10μL. Result： The linear range of syringing is 20.50～102.52μg/mL （r=0.9999）. The average recovery （n=9） is 99.9 % （RSD=0.4%）， the averages （A+2.2S） of the content uniformity are 98.4%（5.2）、93.2%（11.0）、95.5%（10.1）、107.1%（14.8）. Conclusion： The method is simple，accurate，reliable and suitable for content uniformity determination of enrofloxacin tablets.

Keywords： enrofloxacin tablets； content uniformity； high performance liquid chromatography

恩諾沙星（簡(jiǎn)稱(chēng)ENRO）是動(dòng)物專(zhuān)屬的喹諾酮類(lèi)抗菌藥，主要用于細(xì)菌性疾病和支原體感染的防治[1]。它對(duì)包括假單胞菌素屬在內(nèi)的大部分革蘭氏陰性菌具有很強(qiáng)的殺滅作用，對(duì)部分革蘭氏陽(yáng)性菌也有良好的抗菌效果，同時(shí)對(duì)某些支原體、衣原體、立克次氏體也顯示出有效性[2-4]，常用于腸炎、肺炎、子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎、皮膚病及一些軟組織感染的治療[5]。目前，ENRO在獸醫(yī)臨床上已得到廣泛應(yīng)用，特別是在用于治療禽病的片劑中普遍含有該藥，同時(shí)在寵物用藥中也有廣泛的應(yīng)用。

含量均勻度是藥品質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。依據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄“0941含量均勻度檢查法”的規(guī)定，對(duì)于標(biāo)示量不大于10 mg的片劑，應(yīng)進(jìn)行含量均勻度的檢查?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》所收錄的恩諾沙星片規(guī)格為2.5 mg和5 mg?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》2015年版對(duì)恩諾沙星片含量均勻度沒(méi)有要求[6-7]。根據(jù)獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，本中心完成了恩諾沙星片含量均勻度方法的建立，并且此方法已被收錄在《中華人民共和國(guó)獸藥典》2020年版一部中。

1儀器與試藥

1.1儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器；梅特勒公司生產(chǎn)的AX205DR型電子天平；梅特勒公司生產(chǎn)的S220型pH計(jì)；昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器；5 mL注射器；0.22μm濾膜。

1.2試藥

恩諾沙星對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（批號(hào)為H0081505，純度為99.5%）；恩諾沙星片分別購(gòu)自成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：20180601，20180602，20180603；規(guī)格：5 mg），贛州華醫(yī)動(dòng)物藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20180110；規(guī)格：2.5 mg）；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水，乙腈為色譜純，磷酸和三乙胺采用分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件。以Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，0.025 mol/L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0）-乙腈（83∶17）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，進(jìn)樣量為10μL。

2.2溶液配制

配制對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取恩諾沙星對(duì)照品（經(jīng)105℃干燥至恒重），置于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，振搖，再用流動(dòng)相定容，振搖均勻，即制成質(zhì)量濃度約為2 mg/mL的對(duì)照品貯存液。精密量取5 mL，用流動(dòng)相稀釋定容至200 mL，搖勻，即制成對(duì)照品溶液。

配制供試品溶液：取樣品1片（5 mg）置于100 mL容量瓶中或者取樣品1片（2.5 mg）置于50mL容量瓶中，加流動(dòng)相約40 mL，超聲30 min使其溶解，加流動(dòng)相稀釋定容，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后制成供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液的制備：去除恩諾沙星片中的恩諾沙星制備空白片劑，并使用與供試品溶液相同的制備方法進(jìn)行制備。

溶劑空白溶液：取流動(dòng)相適量經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1干擾性試驗(yàn)

在高效液相色譜儀中分別注入空白溶液、陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL。色譜圖（圖1至圖4）顯示，供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處有色譜峰，陰性對(duì)照溶液和溶劑空白溶液在恩諾沙星保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，這表明其他成分及輔料對(duì)恩諾沙星含量測(cè)定無(wú)影響。

2.3.2線性關(guān)系考察

精密量取恩諾沙星對(duì)照品貯存液，用流動(dòng)相稀釋定容，按上述方法進(jìn)行分析，將恩諾沙星溶液的質(zhì)量濃度分別稀釋為20、40、60、80、100μg/mL。線性回歸方程以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，線性回歸方程為：y= 69687.555x-62687.1（r=0.9999）。結(jié)果顯示，溶液濃度在20.50～102.52μg/mL內(nèi)，濃度和峰面積積分值有著良好的線性關(guān)系。

2.3.3精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，連續(xù)6次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量為10μL，根據(jù)色譜圖計(jì)算峰面積。連續(xù)6次恩諾沙星溶液的峰面積RSD為0.14%，表明儀器系統(tǒng)精密度符合要求。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批的恩諾沙星片樣品（20180601），按照上述的方法配制6份供試品溶液，分別注入液相色譜儀，每份的進(jìn)樣體積均為10μL。根據(jù)色譜圖的積分峰面積同法進(jìn)行試驗(yàn)，RSD為0.74%，表明方法重復(fù)性符合要求。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)為20180601的恩諾沙星片樣品，按照上述方法配制供試品溶液，在與整個(gè)試驗(yàn)環(huán)境相同的條件下靜置一段時(shí)間，然后分別于0、4、8、16、24 h注入液相色譜儀，每次注入10μL，根據(jù)色譜圖計(jì)算峰面積。結(jié)果顯示，恩諾沙星的RSD為0.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6加樣回收試驗(yàn)

取恩諾沙星片劑中的其他成分，置于9個(gè)100 mL容量瓶中，然后分別加入0.8、1.0、1.2 mL對(duì)照品貯存液，相當(dāng)于處方量的80%、100%、120%，每個(gè)濃度有3個(gè)恩諾沙星對(duì)照品平行樣。加流動(dòng)相超聲，按供試品溶液方法配制，根據(jù)上述色譜條件測(cè)定，并根據(jù)色譜圖色譜峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.7耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液和對(duì)照品溶液，調(diào)整柱溫為30℃、35℃、40℃，或改變流速為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/ min。以上色譜條件的微小改變對(duì)分離效果、含量測(cè)定均無(wú)明顯影響。

2.4樣品含量均勻度測(cè)定

取成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)股份有限公司和贛州華醫(yī)動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的恩諾沙星片樣品各10片，制備供試品溶液，按“2.1”的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。按外標(biāo)法測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品含量，根據(jù)《中國(guó)獸藥典》2015年版（通則0941）計(jì)算含量均勻度，結(jié)果均符合要求。詳見(jiàn)表2。

3討論與結(jié)論

恩諾沙星片含量均勻度的檢測(cè)方法依據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》（通則0941）。除另有規(guī)定外，通常L值為15.0，對(duì)于某些特殊劑型或情況，L值可能為20.0或25.0。所測(cè)試的樣品已符合標(biāo)準(zhǔn)，且存在通過(guò)提升生產(chǎn)工藝可進(jìn)一步優(yōu)化的空間，同時(shí)本版獸藥典中含量均勻度與《中華人民共和國(guó)藥典》《美國(guó)藥典》的寬松度一致。本試驗(yàn)所選批次的片劑之間含量差異較大，獸藥生產(chǎn)廠家應(yīng)該提高藥品生產(chǎn)水平和工藝，如減少重量差異和優(yōu)化混合工藝等，以提高藥物的混合均勻性，加強(qiáng)對(duì)藥品含量均勻度的質(zhì)量控制。

由于本品在所選溶劑中較易崩解，且為了更加準(zhǔn)確地定量計(jì)算，本試驗(yàn)未采取研磨轉(zhuǎn)移的方法，但同時(shí)比較了振搖和超聲兩種方法對(duì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)振搖和超聲對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響，30 min后溶解度不再增加，因而選擇超聲30 min處理樣品。

本品采用《中華人民共和國(guó)獸藥典》中恩諾沙星片含量的測(cè)定方法，結(jié)果符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》（通則0941）含量均勻度檢查法的要求。采用上述方法可以對(duì)恩諾沙星片進(jìn)行含量均勻度的檢測(cè)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]應(yīng)翔宇，楊永勝.獸用新型抗菌藥物：恩諾沙星[J].中國(guó)獸藥雜志，1995，29（3）：53-56.

[2]吳海坤，方炳虎，時(shí)書(shū)寧，等.恩諾沙星混懸液的研制及其在雞組織中的殘留研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（4）：47-52.

[3]梁靜，李超，黃俊，等.復(fù)方氨酚烷胺片（膠囊）中主成分含量均勻度測(cè)定[J].中國(guó)藥業(yè)，2023，32（23）：7-12.

[4]蘇思尹.吲達(dá)帕胺片含量均勻度測(cè)定方法影響因素的探討[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2018，19（4）：317-320.

[5]田潔，車(chē)寶泉，田菁.HPLC法測(cè)定復(fù)方利血平片中6個(gè)成分的含量均勻度[J].藥物分析雜質(zhì)，2018，38（9）：1634-1640.

[6]紀(jì)建勛.對(duì)比2015版《中國(guó)藥典》與《美國(guó)藥典》中含量均勻度檢測(cè)法[J].中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2017（8）：65-67.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典分析檢測(cè)技術(shù)指南[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2017.

【作者簡(jiǎn)介】

韓春曉，女，1986年出生，高級(jí)畜牧師，碩士，研究方向?yàn)楂F藥檢測(cè)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制修訂。

（編輯：李鈺雙）