川崎病Sema4D/IL6軸介導中性粒細胞和內皮細胞相互作用的研究

【摘要】目的探討信號素4D（Sema4D）/白細胞介素6（IL6）軸在川崎病（KD）中性粒細胞與內皮細胞間的相互作用。方法選取55例急性期KD患兒作為KD組，30例健康兒童作為HC組，ELISA法檢測兩組外周血Sema4D和IL6濃度，流式細胞術檢測中性粒細胞表面Sema4D表達；Sema4D體外刺激內皮細胞并檢測IL6表達；用內皮細胞條件培養基處理中性粒細胞后檢測Sema4D脫落情況。

結果與健康兒童比較，急性期KD患兒外周血Sema4D和IL6明顯升高，而Sema4Dhigh中性粒細胞明顯降低，差異有統計學意義（Plt;0.05）；與未刺激組比較，Sema4D刺激組的內皮細胞IL6表達顯著增加，差異有統計學意義（Plt;0.05）；與未刺激組相比，Sema4D處理組的內皮細胞條件培養基顯著增加中性粒細胞Sema4D的脫落（Plt;0.01）。

結論川崎病冠脈病變過程中可能存在由Sema4D/IL6軸介導的中性粒細胞和內皮細胞互作方式。

【關鍵詞】信號素4D；白細胞介素；川崎病；中性粒細胞；冠狀動脈內皮細胞

中圖分類號：R737.11文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2024.11.004

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of semaphorin 4D （Sema4D）/interleukin6 （IL6） axis in interaction between neutrophils and human coronary artery endothelial cells （HCAECs） in Kawasaki disease （KD）.

MethodsA total of 55 patients with acute KD were selected as KD group， and 30 healthy children were selected as HC group. The concentrations of Sema4D and IL6 in peripheral blood of the two groups were detected by ELISA， and the expressions of Sema4D on the surface of neutrophils were detected by flow cytometry; Sema4D was used to stimulate endothelial cells in vitro and the expressions of IL6 were detected; after treating neutrophils with endothelial cellconditioned medium， the shedding of Sema4D was detected.

ResultsCompared with healthy children， Sema4D and IL6 in peripheral blood in the acute phase of KD significantly increased， while the Sema4Dhigh neutrophils significantly decreased， and difference was statistically significant "（Plt;0.05）. Compared with unstimulated group， the expressions of IL6 in endothelial cells stimulated by Sema4D significantly increased， and difference was statistically significant（Plt;0.05）. Compared with unstimulated group， Sema4Dtreated group's endothelial cellconditioned medium significantly increased the shedding of Sema4D in neutrophils （Plt;0.01）.

ConclusionThere may be a Sema4D/IL6 axis mediated interaction between neutrophils and endothelial cells during the process of coronary artery disease in KD.

【Keywords】semaphorin 4D （Sema4D）; interleukin; Kawasaki disease （KD）; neutrophil; coronary artery endothelial cell

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種以冠脈病變（coronary artery lesion，CAL）為特征的兒童急性血管炎癥性疾病［12］，其發病機制不明。信號素4D（Sema4D）是一種免疫信號蛋白，參與多種炎癥性疾病［34］。我們前期研究發現KD中過度激活的中性粒細胞表面Sema4D脫落，導致外周血Sema4D升高，進而刺激人冠狀動脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC）表達分泌白細胞介素6（interleukin 6，IL6）［5］。研究顯示中性粒細胞和冠狀動脈內皮細胞的相互作用在川崎病冠脈病變（KDCAL）過程中起重要作用［6］，但兩種細胞在KD條件下的相互作用機制尚不清楚。本研究通過體外實驗探討KD條件下Sema4D/IL6軸介導中性粒細胞和內皮細胞的相互作用機制。

1資料與方法

1.1臨床資料

本研究納入2023年1月至12月西安市兒童醫院收治的55例急性期KD患兒和30例健康兒童（為HC組）。KD診斷標準參照美國心臟協會2017年《川崎病的診斷、治療和長期管理》［7］。30例健康兒童的排除標準為：①發熱者；②合并有其他系統急慢性疾病者；③臨床資料不全者。本實驗方案經過西安醫學院醫學倫理審查委員會批準（批準編號：XYLS2022258）。55例KD患兒和30例健康兒童的性別和平均月齡差異無統計學意義（Pgt;0.05）。

1.2儀器與試劑

HCAEC（美國SCIENCELL公司）；全自動酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；NovoCyte D1040流式細胞儀（美國ACEA）；血細胞分析儀（日本Sysmex XN350）；ABI 7500分析儀（美國ABI）；FITC抗人Sema4D抗體，Pacific blueTM抗人CD15抗體，PE抗人Siglec8抗體（美國Biolegend）；重組人源Sema4D（美國Ramp;D）；外周血中性粒細胞分離試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Sema4D和IL6等ELISA試劑盒（中國Abbkine）；RNeasy mini試劑盒（德國Qiagen）；PrimeScript RT Mix（中國大連Takara）。

1.3方法

1.3.1標本采集

采集治療前KD患兒及對照兒童空腹靜脈血8 mL，其中2 mL于促凝管離心分離血清，2 mL于EDTAK2抗凝管進行血常規檢查和流式細胞術（flow cytometry， FCM），4 mL于肝素抗凝管用于中性粒細胞分離。

1.3.2HCAEC培養與處理

在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養HCAEC，細胞融合到70%～80%時接種到6孔板中。當90%融合時，用含1500 ng/mL重組Sema4D的RPMI1640培養基孵育24小時。收集細胞培養上清液待測。每組實驗均重復三次。

1.3.3ELISA檢測

檢測1.3.1收集的血清及1.3.2收集的細胞培養上清液的Sema4D和IL6的濃度。操作按試劑盒說明書進行，全自動酶標儀檢測OD值。

1.3.4中性粒細胞計數和流式細胞術

采用血細胞分析儀進行外周血中性粒細胞計數。流式細胞術檢測1.3.1收集的外周血中性粒細胞表面Sema4D的表達。

1.3.5中性粒細胞的分離、培養和刺激

使用外周血中性粒細胞分離試劑盒分離10例健康兒童的中性粒細胞，經瑞氏染色驗證細胞純度gt;95%。分離的中性粒細胞以1×106/孔的密度接種到24孔板上，用1.3.2收集的細胞培養上清液孵育2小時。收集各孔中性粒細胞，流式細胞術檢測中性粒細胞表面Sema4D。

1.3.6實時熒光定量PCR

提取HCAEC總RNA，逆轉錄cDNA。PCR擴增檢測IL6的mRNA表達。IL6引物：F 5’CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT3’，R 5’CCAGTGCCTCTTTGCTGCTTT3’；GAPDH引物：F 5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3’，R 5’TGGTGAAGACGCCAGTGGA3’。

1.4統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0統計軟件進行統計分析。以均值±標準差（±s）表示。KD組和HC組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗；Sema4D或人血清處理HCAEC與否對白細胞介素產生的影響采用配對t檢驗。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2結果

2.1研究對象實驗指標比較

KD組較HC組外周血中性粒細胞計數升高，高表達Sema4D的中性粒細胞（Sema4Dhigh/CD15+/Siglec8-中性粒細胞）絕對值無統計學意義，而百分比明顯降低（Plt;0.001）。KD組較HC組血清sSema4D和IL6濃度水平增高（Plt;0.001）。見表1。

2.2Sema4D誘導KDHCAEC對白細胞介素的影響

用KD患者血清孵育HCAEC 6 h后加入Sema4D刺激24 h，與未加Sema4D刺激相比，上清液IL6含量［（175.70±7.64） pg/mL vs （101.30±6.11） pg/mL，t=14.190，Plt;0.001］和細胞中IL6 mRNA相對表達量［（2.03±0.15）vs （0.08±0.07），t=8.171，Plt;0.001］均顯著升高。而在健康對照血清孵育HCAEC的條件下，加入Sema4D刺激與否對IL6分泌［（93.00±2.65）pg/mL vs （89.67±7.23） pg/mL，t=1.250，P=0.338］和mRNA相對表達量［（0.99±0.09）vs （0.98±0.02），t=1.142，P=0.900］無影響。

2.3KDHCAEC上清液對中性粒細胞Sema4D脫落的影響

流式細胞分析結果發現，與HC組相比， KDHCAEC的上清液可使Sema4Dhigh中性粒細胞百分比由（89.93±5.65）%顯著降低至（57.75±6.32）%，差異有統計學意義（t=12.013，Plt;0.001）。

3討論

KD是一種兒童全身性血管炎，冠脈炎癥是發生CAL的重要原因。目前KD發病機制仍不明確，但大量證據表明血管內皮細胞炎癥在KDCAL的發生發展中起重要作用［8］。內皮細胞炎癥主要是由血管壁微環境中大量促炎因素導致，這些促炎因素主要來自血液循環的中性粒細胞［9］。中性粒細胞與血管內皮細胞之間的相互作用是導致KD血管炎的重要因素，但二者之間的相互作用機制研究較少。本研究發現KD條件下，中性粒細胞表面的Sema4D脫落導致血清Sema4D升高；Sema4D能夠進一步加重HCAEC的炎癥改變，促使HCAEC產生IL6。本研究結果表明KD微環境下可能存在由Sema4D/IL6反饋環路介導的中性粒細胞和內皮細胞相互炎癥放大作用，這可能是KD血管炎的潛在病理機制之一。

KD急性期表現為外周血中性粒細胞升高并且過度激活［10］。病理研究顯示KD急性期冠脈病變處中性粒細胞是出現浸潤最早的免疫細胞［11］，提示中性粒細胞是KD血管炎癥早期的始動因素。這些在KD早期升高且活化的中性粒細胞自發凋亡減弱而促炎能力增強［12］。過度活化的中性粒細胞浸潤血管壁并釋放多種促炎物質，可通過直接或間接的方式作用于血管壁從而導致CAL［13］。我們前期研究發現KD患兒中性粒細胞表面Sema4D表達減少，說明KD條件下中性粒細胞活化后Sema4D脫落增加，導致外周循環Sema4D水平升高；進一步發現Sema4D通過與細胞表面受體結合促進HCAEC分泌白細胞介素，證明Sema4D能夠促進內皮細胞炎癥［5］。近年來相關研究表明Sema4D在多種免疫炎癥性疾病中發揮關鍵作用［14］，且外周血Sema4D濃度與炎癥程度相關。本研究團隊前期也發現循環中Sema4D水平與CRP和KD冠脈病變程度呈正相關［2］，楊群智等［14］也發現 Sema4D與類風濕關節炎病情活動有關，這提示Sema4D可作為炎癥標志物預測KDCAL的風險。

血管內皮細胞炎癥反應是KD冠脈損傷的另一重要特征［15］。通過KD血清刺激內皮細胞體外造模發現，在KD微環境下內皮細胞發生凋亡增強等諸多功能失調的表型變化［16］。本研究發現與健康兒童血清處理組相比，KD血清刺激的HCAEC高表達IL6，說明KD條件下血管內皮細胞發生炎性改變。LI等［17］研究發現KD血清IL6水平升高，這與本研究結果一致。KD條件下IL6的來源還未明確，本研究發現Sema4D可刺激KDHCAEC高表達并分泌IL6，說明血管內皮細胞可能是IL6的來源之一，IL6與KD之間的確切關系還需要更深入的研究。本研究發現KDHCAEC上清液含IL6可促使中性粒細胞活化脫落Sema4D，而采用健康對照血清孵育的HCAEC上清液則無此能力，這表明HCAEC與中性粒細胞之間存在Sema4D/IL6介導的相互作用。

綜上所述，中性粒細胞來源的Sema4D促進KDHCAEC分泌IL6，HCAEC產生的IL6又可反饋作用于中性粒細胞。基于這些結果，我們認為Sema4D/IL6軸在KD血管炎及CAL的發生發展中起重要作用，針對Sema4D的靶向治療可能是KD急性期的潛在靶點。

參考文獻

［1］ DAYLEWIS M， SON M B F， LO M S. Kawasaki disease：contemporary perspectives［J］. Lancet Child Adolesc Health，2024，8（10）：781792.

［2］ 中華醫學會兒科學分會心血管學組，中華醫學會兒科學分會風濕學組，中華醫學會兒科學分會免疫學組，等.川崎病診斷和急性期治療專家共識［J］.中華兒科雜志，2022，66 （1）：613.

［3］ KUKLINA E. Semaphorin 4D as a guidance molecule in the immune system［J］. Int Rev Immunol，2021，40（4）：268273.

［4］ NOJIMA S. Class IV semaphorins in disease pathogenesis［J］. Pathol Int，2022，72（10）：471487.

［5］ HUANG J H， WU S Z， CAO S C， "et al. Neutrophilderived semaphorin 4D induces inflammatory cytokine production of endothelial cells via different plexin receptors in Kawasaki disease［J］. Biomed Res Int，2020，2020：6663291.

［6］ HARA T， NAKASHIMA Y， SAKAI Y， et al. Kawasaki disease：a matter of innate immunity［J］. Clin Exp Immunol， 2016，186（2）：134143.

［7］ MCCRINDLE B W， ROWLEY A H， NEWBURGER J W， et al. Diagnosis，treatment，and longterm management of Kawasaki disease：a scientific statement for health professionals from the American heart association［J］. Circulation， 2017，135（17）：e927e999.

［8］ KUMRAH R， GOYAL T， RAWAT A， et al. Markers of endothelial dysfunction in Kawasaki disease：an update［J］. Clin Rev Allergy Immunol，2024，66（1）：99111.

［9］ AYMONNIER K， AMSLER J， LAMPRECHT P， et al. The neutrophil：a key resourceful agent in immunemediated vasculitis［J］. Immunol Rev，2023，314（1）：326356.

［10］ 張書婉，黃君華，吳文婧，等.外周血NLR與PLR對兒童完全型川崎病冠狀動脈損傷的預測分析［J］.現代檢驗醫學雜志，2020，35（6）：3841.

［11］ TAKAHASHI K， OHARASEKI T， NAOE S， et al. Neutrophilic involvement in the damage to coronary arteries in acute stage of Kawasaki disease［J］. Pediatr Int，2005，47（3）：305310.

［12］ TSUJIMOTO H， TAKESHITA S， NAKATANI K， et al. Delayed apoptosis of circulating neutrophils in Kawasaki disease［J］. Clin Exp Immunol，2001，126（2）：355364.

［13］ XIE Z Y， HUANG Y D， LI X Y， et al. Atlas of circulating immune cells in Kawasaki disease［J］. Int Immunopharmacol，2022，102：108396.

［14］ 楊群智，馬向波，李玉慧，等.Sema4D與類風濕關節炎病情活動、骨破壞及繼發肺間質病變相關性分析［J］.中華醫學雜志，2020，100（20）：15671572.

［15］ PATRA P K， BANDAY A Z， DAS R R， et al. Longterm vascular dysfunction in Kawasaki disease：systematic review and metaanalyses［J］. Cardiol Young，2023，33（9）：16141626.

［16］ 劉麗莎，談誠，李喆倩，等.川崎病合并冠脈損傷患兒血清抑制HUVECs增殖并誘導其凋亡［J］.南京醫科大學學報（自然科學版），2017，37（4）：434436.

［17］ LI Y D， ZHENG Q， ZOU L X， et al. Kawasaki disease shock syndrome：clinical characteristics and possible use of IL6，IL10 and IFNγ as biomarkers for early recognition［J］. Pediatr Rheumatol Online J，2019，17（1）：1.

（收稿日期：2024-08-23修回日期：2024-09-29）

（編輯：潘明志）

基金項目：陜西省大學生創新創業訓練計劃項目（S202311840077，S202311840070）；西安醫學院大學生創新創業訓練計劃項目（121523077，121523070）

第一作者簡介：王雪蓉，女，在讀本科生。Email：15091650020@163.com

▲通信作者：黃君華。Email：huangjunhua1985@163.com

［本文引用格式］王雪蓉，張笑，唐欣妮，等.川崎病Sema4D/IL6軸介導中性粒細胞和內皮細胞相互作用的研究［J］.右江醫學，2024，52（11）：979982.