基于網絡藥理學和分子對接的中藥菊花治療視神經病變的作用機制分析

摘要：通過TCMSP數據庫對菊花活性成分進行篩選，預測菊花活性成分的潛在靶點并收集該疾病的靶點。分析構建中藥成分靶點網絡，蛋白互作（PPI）網絡以及核心靶點，根據靶點GO分析和KEGG通路富集分析，由分子層面驗證菊花有效成分同關鍵靶點分子的對接狀況。在治療視神經病變方面，菊花有效成分主要涉及木犀草素、山萘酚、槲皮素與金合歡素。通過調控關鍵靶點蛋白TNF、IL6、IL1B、JUN、TP53、VEGFA、EGFR、CCL2、CAT、PPARG表達，涉及氧化應激反應，細胞對氮化合物的反應，細胞凋亡與衰老、炎癥反應等，減緩神經發生病變。研究結果表明菊花可能通過多組分、多靶點、多途徑治療青光眼，但這一結果還需更多實驗驗證。

關鍵詞：菊花;槲皮素;木犀草素;視神經病變;網絡藥理學;氧化應激反應;TNF;IL6;IL1B菊花是我國傳統的平肝明目中藥，最早記載于《神農本草經》，臨床上常用于治療風熱感冒、眼目昏花、目赤腫痛等［1］。在世界性致盲主導因素中，青光眼是重要的致盲因素，是視網膜神經節細胞丟失及軸突凋亡、視神經進行性萎縮、變形等［2］。其發病機制復雜，臨床上尚缺乏療效確切的治療方法。目前現有文獻對菊花治療青光眼性視神經病變研究較少，治療機制亦不明確。本研究以菊花為研究對象，基于網絡藥理學分析菊花與青光眼性視神經病變之間成分靶點通路，結合分子對接方法對結果進行驗證，為菊花在后期的應用與開發提供一定參考。

1方法

1.1篩選菊花藥效成分及作用靶點

在中藥系統藥理學數據庫（TCMSP：https：//old.tcmspe.com/index.php）搜索關鍵詞“菊花”對化學成分進行檢索，經由設置類藥性（DL）≥0.18、OB（口服利用度）≥30%，篩選菊花主要活性成分及對應靶點，保存活性成分2D結構。經由數據庫Pub Chem（網址為https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/），明確SDF結構，向數據庫Swiss Target Prediction導入， 藥物作用靶點的標準為：評分在0以上。經由數據庫Uniprot （網址為https：//www.uniprot.org/）完成蛋白質靶點命名向標準基因命名的轉變，從而確定菊花基因靶點。

1.2視神經病變靶點基因獲取

以檢索詞“glaucoma”，GeneCards（https：//www.genecards.org/ds）、OMIM（https：//omim.org/）、Drugbank（https：//go.Drugbank.com/）、Disgenet（https：//www.disgenet.org/）在數據庫檢索， 將疾病靶點基因去重合并，得到與視神經病變相關的靶點基因。

1.3疾病與藥物共同作用靶點預測

借助Venny2.1 （網址為https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）完成韋恩圖的制作，以此對藥物疾病共同靶點加以明確，同時探究雙方相關性。

1.4中藥成分靶點網絡構建及分析

經由軟件Cytoscape 3.8.2完成“中藥藥物成分靶點疾病”網絡圖的制作，根據菊花主要有效物質和靶點內各代表節點度值、緊密度和介度等分析，探討菊花對青光眼性視神經病變關鍵藥效成分與核心作用靶點。

1.5蛋白互作網絡構建以及核心靶點分析

在string數據庫（https：//stringdb.org/）中輸入獲得藥物與疾病共同靶點，選擇“Multiple proteins”，蛋白類型為智人“homo sapiens”，最低互作閾值為0.4，得到蛋白互作（PPI）關系。PPI網絡導入Cytoscape軟件，根據Degree值大小篩選，核心靶點篩選原則為選取分值大于平均分的基因，篩選出關鍵靶點蛋白，構建PPI核心作用模塊。

1.6靶點GO功能富集分析及KEGG信號通路的富集分析向數據庫Metascape（https：//metascape.org）內導入菊花有效成分和青光眼疾病交集基因，物種的分析、錄入皆采取H.sapiens，實施GO富集分析，具體涉及BP（生物過程）、CC（細胞成分）以及MF（分子功能）分析。利用KEGG數據庫進行靶點基因通路富集分析。設置閾值Plt;0.05，P value 按照升序順序排列，篩選生物過程存在顯著差異并且靶點通路可靠，使用微生信在線分析工具，將結果可視化輸出。

1.7菊花關鍵成分與核心靶點分子對接驗證

將菊花關鍵成分向數據庫Pub Chem（網址為https：//pubchem.ncbi.nim.nih.gov/）內導入檢索，得到核心物質結構SDF格式，借助軟件Chem3D對藥物成分開展能量最小化處理，在mol格式存儲。借助數據庫PDB（網址為https：//www.rcsb.org/）完成較高分析度值核心靶點蛋白3D結構的下載，并存儲為PDB格式。將活性成分及疾病核心靶點蛋白導入SYBYLX2.1.1軟件，對疾病靶點蛋白提取小分子配體、去除水分子、加氫等預處理，受體和配體進行半柔性分子對接，對接結果函數打分，取高分的對接構象圖繪制示意圖。

2結果

有效成分經篩選符合條件為18個，利用Swiss Target Prediction數據庫找到119個藥物靶點。借助數據庫GeneCards、Drugbank、Disgenet與OMIM篩選出1 449個疾病靶點，進行韋恩圖的制作（圖1），得到46個藥物疾病共同靶點。

向數據庫String內輸入交集靶點，得到PPI網絡，經由軟件Cytoscape完成網絡可視化處理。結果如圖2所示，藍色菱形表示菊花主要有效成分，橢圓形表示青光眼視神經病變基因靶點，綠色方形代表活性物質對應的靶點基因，涉及46個網絡共節點，邊數452條，使用Cytoscape軟件插件CytoNCA，提取網絡中得分較高的節點，以介數和自由度中位數為節點，根據條件選擇，篩選出21個核心基因。網絡中degree值前10靶點為：TNF、IL6、IL1B、JUN、TP53、VEGFA、EGFR、CCL2、CAT、PPARG，如圖3。

GO分析將交集靶點富集分析的功能（Molecular Function，MF）條目為63個，與氧化還原酶功能、信號受體調節功能、抗氧化功能、細胞因子（CK）功能、生長因子（GF）功能、受體配體功能等相關，CC條目合計41個，涉及膜微區、囊泡腔、脂筏、分泌顆粒腔等，BP合計905個條目，涉及氧化應激反應，細胞對氮化合物的反應，細胞凋亡與衰老、炎癥反應等，結果見圖4。

經KEGG通路分析明確出132個條目，具體如圖5所示，顯示菊花治療視神經保護通路，主要涉及PI3KAkt信號通路、FoxO信號通路、活性氧、JAKSTAT信號通路、Ras信號通路、TNF信號通路、神經退行性病變的途徑多種疾病、過氧化物酶體、VEGF信號通路、谷胱甘肽代謝等通路。

分子對接分析金合歡素、山萘酚、木犀草素、槲皮素活性成分與IL1B對接結果均大于4.25，表明分子與IL1B、TNF直接存在結合活性（見圖6），特別是TNF與分子的對接均大于5，表明結合活性較高，這一結果與前期分析的疾病、成分、靶點對應關系一致。TNF槲皮素IL1B木犀草素IL6木犀草素

3討論

在非可逆性致盲的各種原因中，青光眼是重要的致病原因。認識青光眼性視神經損傷的相關因素，對保護青光眼患者的視功能，具有十分重要的意義。

通過分析得到菊花主要活性成分包括木犀草素、槲皮素、山萘酚、金合歡素等18種。構建“成分靶點疾病”的網絡，金合歡素、異鼠李素、山萘酚、木犀草素、槲皮素是治療青光眼的主要潛在活性成分，靶點包括PPARG、TNF、CAT、IL6、CCL2、IL1B、EGFR、JUN、VEGFA、TP53。金合歡素可提高神經元存活率，能夠免受氧化應激和炎癥影響，通過抑制TGFβ1、Smad3 mRNA和蛋白質的表達，抑制TGFβ1/Smad3信號通路。槲皮素有神經保護作用，可通過PI3KAkt信號通路調控下游炎癥因子的生成進而抑制炎癥反應［3］，介導MAPK信號通路，抑制對氧磷酶2的表達，抵抗氧化應激損傷;降低NO和NO合酶蛋白水平，減少核轉錄因子κB的核轉位，發揮抗炎作用［4］。木犀草素具有抗炎、抗氧化、抗癌、細胞保護等作用。可抑制細胞凋亡，減輕RIRI對視網膜細胞造成的損傷［5］。

4結論

深入探究分析菊花治療青光眼的作用機制，研究結果表明菊花治療青光眼可通過多組分、多靶點、多途徑進行，研究結果需要在分子及動物實驗中再加以驗證，可為菊花深入開發應用提供一定的參考。

參考文獻：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.

［2］鄭建君，楊霄敏.基于TGFβ1/Smad3信號通路探討金合歡素對急性腦梗死大鼠神經功能的保護作用［J］.中國藥師，2020，23（7）：13501354.

［3］祝珊珊，譚博文.槲皮素通過PTEN/PI3K/JNK信號通路減輕小鼠RAW264.7巨噬細胞炎癥［J］.中國病理生理雜志，2023，39（3）：510519.

［4］趙雨薇，戴月英.槲皮素神經保護作用研究進展［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2021，35（9）：644645.

［5］李茜，王紅星.木犀草素對視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）大鼠TLR4/Syk/NFκB信號通路及視網膜的影響［J］.眼科新進展，2021，41（4）：311316.

基金項目：遼寧省教育廳基金資助項目（LJKZ1397）

作者簡介：張宇婷，女，遼寧沈陽人，副教授，碩士研究生，研究方向：分子生藥學及藥理學。