谷子細(xì)胞色素P450基因與株高的關(guān)聯(lián)分析

摘 要： 通過對160份谷子材料進(jìn)行重測序，在CYP450基因內(nèi)共檢測到48個SNP位點(diǎn)，所有位點(diǎn)都位于編碼區(qū)。基于SNP位點(diǎn)的群體結(jié)構(gòu)分析將160份谷子材料劃分為2個群，第一群包括137個品種，主要來自河南省、河北省、內(nèi)蒙古等地方，第二群包括23個品種，主要來自遼寧省、陜西省等地方。對谷子生長素應(yīng)答蛋白基因的48個SNP位點(diǎn)來進(jìn)行的連鎖不平衡的結(jié)構(gòu)分析，當(dāng)R2=1時，有一組明顯較大的連鎖不平衡的結(jié)構(gòu)，包括7個SNP位點(diǎn)，分別為SNP-3、SNP-8、SNP-12、SNP-13、SNP-14、SNP-18、SNP-35，這些基因位點(diǎn)都位在于編碼區(qū)外顯子中。GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)有7個，分別是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在這7個谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)3個為錯義突變，分別是SNP-16氨基酸由Leu突變?yōu)镮le，SNP-17氨基酸由Leu突變?yōu)閂al，SNP-28氨基酸由Gly突變?yōu)镾er，其余4個為無義突變。本研究初步證明谷子CYP450基因與株高有密切關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步研究CYP450基因?qū)茸又旮叩恼{(diào)控作用提供了有力的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：谷子；重組自交系；農(nóng)藝性狀；主基因+多基因；遺傳模型

中圖分類號：S515" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）10-0005-08

收稿日期：2023-12-04 修回日期：2023-12-31

基金項目：河南省重點(diǎn)研發(fā)專項（231111110300）;河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（S2020-14）;河南省農(nóng)業(yè)良種聯(lián)合攻關(guān)項目（2022010401）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（nycytx-CARS-06）;河南省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項目（Z20221341070）;河南省農(nóng)科院科技創(chuàng)新團(tuán)隊（2023TD036）。

第一作者簡介：秦家范（1972-），男，副研究員，主要從事谷子遺傳育種工作。

通信作者： 王自力，賈小平。

Correlation Analysis of Cytochrome P450 Gene and Plant Height "in Foxtail Millet %（Setaria italica） %

QIN Jiafan1，TIAN Lu2，LI Xiaoyan1，ZHANG Xiaomei2，LIU Zhongling1，LIU Hui2， HAN Judong1，CHU Yingying1，JIA Xiaoping2，WANG Zili1

（1.Luoyang Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Luoyang， Henan 471022， China； 2.College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471023， China）

Abstract： By resequencing 160 'Setaria italica' materials， 48 SNP sites were detected in the CYP450 gene， all located within the coding region. Population structure analysis based on these SNP loci divided the 160 %Setaria italica %materials into two groups. The first group， consisting of 137 varieties， was primarily from Henan， Hebei， Inner Mongolia， and other regions. The second group， comprising 23 varieties， was mainly from Liaoning， Shaanxi， and other areas. A linkage disequilibrium analysis of the 48 SNP sites in the %Setaria italica %auxin response protein gene revealed that， when R2 = 1， a significantly larger linkage disequilibrium structure was present， which included 7 SNP sites： SNP-3， SNP-8， SNP-12， SNP-13， SNP-14， SNP-18， and SNP-35， all located within exons of the coding region. There were 7 SNP loci in the %Setaria italica% CYP450 gene identified by both the GLM and MLM models： SNP-16， SNP-17， SNP-21， SNP-28， SNP-31， SNP-39， and SNP-43. Of these 7 SNP sites， 3 were missense mutations： SNP-16 involved a Leu to Ile mutation， SNP-17 involved a Leu to Val mutation， and SNP-28 involved a Gly to Ser mutation， while the remaining 4 were nonsense mutations. This study provides preliminary evidence that the %Setaria italica% CYP450 gene is closely related to plant height， laying a strong foundation for future efforts to regulate plant height in %Setaria italica% via CYP450 gene manipulation.

Key words：%Setaria italica; %CYP450; Plant height; SNP locus; Association analysis

谷子（%Setaria italica%）屬禾本科，古稱稷、粟、亦稱粱。谷子的染色體為2n=18。谷子最先出現(xiàn)在中國大陸，其在作物中享有\(zhòng)"百谷之長\"的美譽(yù)，并位居首位。谷子適應(yīng)能力強(qiáng)，適宜種植在海

拔1 000 m以下和23～32 ℃的環(huán)境下，屬于耐旱、耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)的高產(chǎn)量農(nóng)作物[1]。廣泛種植于我國北方和黃河中上游地區(qū)，其他地區(qū)也有種植，我國種植總面積占世界播種面積九成左右[2～10]。

細(xì)胞色素P450（cytochromeP450，簡稱CYP450）代表著一個很大的可自身氧化的亞鐵血紅素蛋白家族，是單氧酶的一種，因其在450 nm有特異吸收峰因此命名為CYP450[3]。在內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝和活動中具有重要的作用。依照氨基酸序列的同源程度，其成員又依次分為家族、亞家族和酶個體三級。在許多植物中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450類蛋白對生育期、木質(zhì)素有重要影響進(jìn)而影響作物株高，對植物株型結(jié)構(gòu)的形成有調(diào)控作用[4]。

如今有關(guān)谷子的研究在生物技術(shù)方面廣泛涉及，但是針對谷子細(xì)胞色素P450基因與株高之間的關(guān)系相對較少，他們之間存在著什么樣的聯(lián)系呢？本實(shí)驗將會對谷子細(xì)胞色素P450基因與株高進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，本研究通過重測序分析160份谷子材料細(xì)胞色素P450基因的突變位點(diǎn)，同時在洛陽連續(xù)兩年測定160份谷子的株高，用TASSEL軟件GLM和MLM兩種模型開展CYP450基因突變位點(diǎn)與株高的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘與株高緊密關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，探尋其之間的緊密關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取的160份谷子材料包括來自中部（河南省、山東省、河北省）、西北部（陜西省、新疆省、甘肅省、青海省、寧夏省、西藏省、山西省）、東北部（黑龍江省、吉林省、遼寧省、）和內(nèi)蒙高原等國內(nèi)各地區(qū)的品種資源144份，還有來自日本、美國、朝鮮、德國等國外的品種資源16份。

1.2 試驗方法

1.2.1 谷子材料的種植及株高調(diào)查 2021年、2022年連續(xù)兩年將160份谷子材料種植于洛陽市農(nóng)林科學(xué)院試驗田，每個品種種植1行，株距3～5 cm，行距50 cm左右，定期澆水施肥。成熟期選取每行中部10株測量株高，取平均值作為最終的測量值。

1.2.2 160份谷子材料基因組DNA提取及重測序 谷子出苗一周左右，取新鮮幼嫩葉片，采用CTAB法進(jìn)行160份谷子材料基因組DNA的提取。將質(zhì)量檢測合格的DNA樣品送至深圳華大基因進(jìn)行重測序，開發(fā)SNP標(biāo)記。

1.2.3 CYP450基因突變位點(diǎn)與株高的關(guān)聯(lián)分析 把兩年所測的160份谷子材料株高數(shù)據(jù)按照軟件要求進(jìn)行格式整理，利用TASSEL5.0軟件中的GLM和MLM兩種模型進(jìn)行CYP450基因突變位點(diǎn)與株高間的關(guān)聯(lián)分析。

1.2.4 谷子CYP450基因的生物信息學(xué)預(yù)測 從phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）下載獲得谷子CYP450的基因組序列、CDS序列及推定的蛋白質(zhì)序列，基于 Swiss‐model（http：//swissmodel.expasy.org/）在線分析工具同源建模的自動模式進(jìn)行的谷子CYP450基因應(yīng)答蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。應(yīng)用在線軟件Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）對谷子CYP450基因蛋白質(zhì)性質(zhì)測定。

1.2.5 基于CYP450基因 SNP位點(diǎn)的160份谷子材料群體結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)重測序獲得的CYP450基因SNP位點(diǎn)信息，用STRUCTURE2.0軟件分析160份谷子材料的群體結(jié)構(gòu)。

1.2.6 CYP450基因 SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡（LD）分析 運(yùn)用TASSEL5.0軟件分析CYP450基因SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子CYP450基因生物信息學(xué)分析

從phytozome數(shù)據(jù)庫獲得CYP450基因的基因組序列1 300 bp，包含完整編碼區(qū)域（圖1）。基因的CDS序列全長為1 119 bp（圖2），推定的蛋白質(zhì)序列為372個氨基酸（圖3）。

對CYP450基因編碼的蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)谷子CYP450蛋白的分子量為107 355.75 kD，等電點(diǎn)為4.92，其不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）達(dá)到51.20，為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，谷子CYP450蛋白總平均親水性為0.896，表明谷子CYP450蛋白為疏水蛋白，谷子CYP450蛋白不含任何跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于膜蛋白，可能位于細(xì)胞質(zhì)中。谷子CYP450蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白包含8個α螺旋，8個無規(guī)則卷曲，9個β折疊組成，含2個結(jié)構(gòu)域（圖4）。

2.2 谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)篩選

基于重測序結(jié)果在160份谷子CYP450基因組序列間檢測到48個SNP突變位點(diǎn)（表1），對檢測到的48個SNP突變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)沒有SNP位于基因內(nèi)含子區(qū)域，48個SNP位于CDS區(qū)域外顯子上，沒有SNP位于5’UTR和3’UTR（表1）。

2.3 基于谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)160份谷子材料群體結(jié)構(gòu)分析

群體結(jié)構(gòu)分析將160份谷子材料劃分為2個群，其中第一類群包含137個品種，主要來自中國河南省，中國河北省，中國內(nèi)蒙古等地方，第二類群包含23個品種，主要來自中國遼寧省，中國陜西省等地方。（圖5）

2.4 谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析

對谷子生長素應(yīng)答蛋白基因的48個SNP位點(diǎn)來進(jìn)行的連鎖不平衡的結(jié)構(gòu)分析，當(dāng)R2=1時，有一組明顯較大的連鎖不平衡的結(jié)構(gòu)，包括7個SNP位點(diǎn)，分別為SNP-3、SNP-8、SNP-12、SNP-13、SNP-14、SNP-18、SNP-35，這些基因位點(diǎn)都位在于編碼區(qū)外顯子中（圖6，表2）。

2.5 谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)與株高的關(guān)聯(lián)分析

連續(xù)兩年在洛陽地區(qū)測定了160份的谷子材料的株高，并用TASSEL軟件的GLM和MLM兩種模型對谷子CYP450基因與株高進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。2021年用GLM模型檢測到谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)與株高關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有12個，分別為SNP-1、SNP-16、SNP-17、SNP-2、SNP-21、SNP-24、SNP-26、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-4、SNP-43，這些標(biāo)記可解釋的表型貢獻(xiàn)率在0.03到0.05之間（表3）。

2022年用MLM模型在檢測到谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)與株高關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有7個，分別是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43，這些位點(diǎn)可解釋的表型變異貢獻(xiàn)率在0.03到0.05之間（表4）。

GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)有7個，分別是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在這7個谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)3個為錯義突變，分別是SNP-16氨基酸由Leu突變?yōu)镮le，SNP-17氨基酸由Leu突變?yōu)閂al，SNP-28氨基酸由Gly突變?yōu)镾er，其余4個為無義突變（表5）。

3 討論

3.1 CYP450基因株高關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的位置分析

GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)有7個，分別是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在這7個谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)都位于編碼區(qū)外顯子中，其中3個SNP位點(diǎn)為錯義突變，分別是SNP-16氨基酸由Leu突變?yōu)镮le，SNP-17氨基酸由Leu突變?yōu)閂al，SNP-28氨基酸由Gly突變?yōu)镾er，其余4個為無義突變。姜達(dá)等[5]在對香稻的分析中指出外顯子的突變是導(dǎo)致稻米變香的原因。葛生珍[6]研究水稻黃化中證明水稻外顯子突變導(dǎo)致突變株發(fā)育不正常，不能進(jìn)行光合作用，導(dǎo)致突變株死亡。李雯等[7]在研究谷子Si-SP1小穗突變基因中發(fā)現(xiàn)外顯子的突變，導(dǎo)致了穗部變小，同時株高降低，根系變小等等表現(xiàn)型變異。本研究發(fā)現(xiàn)的和谷子株高有關(guān)聯(lián)性的谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)都穩(wěn)定在編碼區(qū)外顯子區(qū)域，說明了CYP450基因應(yīng)答蛋白基因的編碼區(qū)外顯子區(qū)域變異位點(diǎn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變使功能發(fā)生變化，從而對谷子株高有一定的調(diào)節(jié)作用。

3.2 CYP450基因功能

細(xì)胞色素P450（cytochromeP450，簡稱CYP450）代表著一個很大的可自身氧化的亞鐵血紅素蛋白家族，是單氧酶的一種，因其在450 μm有特異吸收峰因此命名為CYP450。根據(jù)氨基酸序列的同源程度，其成員又依次分為家族、亞家族和酶個體三級。1958 a，在肝細(xì)胞微粒體中發(fā)現(xiàn)了這些細(xì)胞色素。這個細(xì)胞色素家族的成員存在于進(jìn)化道路上從細(xì)菌到人類的所有生物中。在原核生物中，CYP的功能是可塑性的，而在真核生物中，它們的功能是不同的。哺乳動物CYP是細(xì)胞膜的一個組成部分，參與許多生理活性物質(zhì)的生物合成和代謝。它存在于除骨骼肌和成熟紅細(xì)胞外的所有器官和組織中，參與催化生物轉(zhuǎn)化[8]。

從功能意義上植物CYP450基因可以分為兩大類型，一類是具有生物合成功能的CYP450基因，此類P450在木質(zhì)素中間物、植物激素、萜類、黃酮類、等生物物質(zhì)的合成中起重要作用;另一類為代謝解毒的CYP450基因，可以催化外源化合物如除草劑、農(nóng)藥等變成非毒性產(chǎn)物，它參與內(nèi)源物質(zhì)和外源物質(zhì)的代謝，包括藥物和環(huán)境化合物。在許多植物中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450類蛋白對生育期生育期、株高有重要影響，對植物株型結(jié)構(gòu)的形成有調(diào)控作用[9]。

4 結(jié)論

通過對160份谷子材料進(jìn)行重測序，在CYP450基因內(nèi)共檢測到48個SNP位點(diǎn)，所有位點(diǎn)都位于編碼區(qū)。基于SNP位點(diǎn)的群體結(jié)構(gòu)分析將160份谷子材料劃分為2個群，第一群包括137個品種，主要來自河南省、河北省、內(nèi)蒙古等地方，第二群包括23個品種，主要來自遼寧省、陜西省等地方。對谷子生長素應(yīng)答蛋白基因的48個SNP位點(diǎn)來進(jìn)行的連鎖不平衡的結(jié)構(gòu)分析，當(dāng)R2=1時，有一組明顯較大的連鎖不平衡的結(jié)構(gòu)，包括7個SNP位點(diǎn)，分別為SNP-3、SNP-8、SNP-12、SNP-13、SNP-14、SNP-18、SNP-35，這些基因位點(diǎn)都位在于編碼區(qū)外顯子中。連續(xù)兩年在洛陽地區(qū)測定了160份的谷子材料的株高，并用TASSEL軟件的GLM和MLM兩種模型對谷子CYP450基因與株高進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。用GLM模型檢測到谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)與株高關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有12個，分別為SNP-1、SNP-16、SNP-17、SNP-2、SNP-21、SNP-24、SNP-26、SNP-28、SNP-31、SNP-39、 SNP-4、SNP-43。用MLM模型在檢測到谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)與株高關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有7個，分別是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。GLM模型和MLM模型共有的谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)有7個，分別是SNP-16、SNP-17、SNP-21、SNP-28、SNP-31、SNP-39、SNP-43。在這7個谷子CYP450基因SNP位點(diǎn)3個為錯義突變，分別是SNP-16氨基酸由Leu突變?yōu)镮le，SNP-17氨基酸由Leu突變?yōu)閂al，SNP-28氨基酸由Gly突變?yōu)镾er，其余4個為無義突變。

本研究初步證明谷子CYP450基因與株高有密切關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步研究CYP450基因?qū)茸又旮叩恼{(diào)控作用提供了有力的依據(jù)。

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