提升頭孢菌素C 發(fā)酵效率的復(fù)合碳源補料工藝開發(fā)及代謝機制

摘要：開發(fā)了一種以葡萄糖和豆油為底物碳源的復(fù)合補料策略，能夠顯著提升頭孢菌素C（CPC）的合成效率，使其產(chǎn)量提升了14.8%，并觀測到碳源變化在宏觀呼吸代謝、中間代謝物、細(xì)胞內(nèi)通量分配和還原力NADPH 利用方面產(chǎn)生了全局影響， 其中二氧化碳釋放速率（CER）的變化表明在葡萄糖和豆油復(fù)合補料策略下細(xì)胞中心代謝網(wǎng)絡(luò)的通量發(fā)生了明顯改變，碳流向CPC 的通量得到增強，同時促進了蛋氨酸和絲氨酸的胞外吸收。胞內(nèi)有機酸α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸的濃度明顯提升，有利于谷氨酸、纈氨酸和半胱氨酸等核心氨基酸的合成，從而有利于CPC 生產(chǎn)。主成分分析（PCA）的載荷測定結(jié)果表明大多數(shù)氨基酸和CPC 合成呈正相關(guān)，谷氨酸的胞內(nèi)含量與CPC 合成的關(guān)聯(lián)性最強，而α-氨基己二酸和賴氨酸積累反而不利于CPC 合成。細(xì)胞還原力方面，豆油和葡萄糖組合工藝有助于NADPH 更多地用于CPC 合成，使得CPC 快速合成時對NADPH 的大量需求得到了滿足。這些結(jié)果表明改變底物能夠?qū)?xì)胞內(nèi)部的代謝產(chǎn)生全方位的影響，復(fù)合補料策略在優(yōu)化CPC 合成中具有巨大潛力。

關(guān)鍵詞：頭孢菌素C；碳源；呼吸代謝；代謝通量分析；主成分分析

中圖分類號：Q815 文獻標(biāo)志碼：A

頭孢菌素類藥物占據(jù)抗感染類藥物50% 以上的市場份額，國內(nèi)市場規(guī)模已達400 多億元，因此其前體頭孢菌素C（CPC）的生產(chǎn)研究備受關(guān)注。CPC 是由頂頭孢霉菌（Acremonium chrysogenum）發(fā)酵生產(chǎn)的次級代謝產(chǎn)物，與一般次級代謝物的合成調(diào)控類似，CPC 的發(fā)酵水平同樣受到碳代謝調(diào)控、氮代謝調(diào)控、磷代謝調(diào)控等影響[1]，其中碳源效應(yīng)受到持續(xù)關(guān)注[2]。通常來講，能夠快速利用的碳源會嚴(yán)重抑制次級代謝產(chǎn)物的合成，因此發(fā)酵培養(yǎng)基定制策略往往是前期采用快速利用的碳源如葡萄糖、麥芽糖等促進菌體生長，待快速碳源耗竭后，中后期采用慢速利用的碳源如油脂、淀粉等用于刺激次級代謝產(chǎn)物的合成[2]，這個策略在很多次級代謝產(chǎn)品的生產(chǎn)中得到了應(yīng)用，比如諾卡氏菌（Nocardia lactamdurans）只有在葡萄糖消耗到極低濃度后，依托霉素才啟動合成，而大豆油則促進了依托霉素的生物合成[3]；白色鏈霉菌在豆油作為底物時，產(chǎn)生的抗生素濃度明顯更高[4]；蓖麻油是更適合紅色糖多孢菌產(chǎn)紅霉素的碳源[5]；甘油或植物油能夠刺激克拉維酸的合成[6]；頭霉素C 能以豆油作為唯一碳源進行發(fā)酵生產(chǎn)[7]，這些結(jié)果表明油脂用于次級代謝產(chǎn)物合成具備普遍性的優(yōu)勢。

在頂頭孢霉菌中，CPC 合成途徑中的擴環(huán)酶基因cefEF 和環(huán)化酶基因pcbC 的上游序列存在碳分解代謝調(diào)控蛋白Cre1 的結(jié)合位點，cefEF 和pcbC 的轉(zhuǎn)錄水平在葡萄糖培養(yǎng)基中受到阻遏，表達水平顯著下降[2]，而豆油不會阻遏CPC 合成途徑中的基因表達，因此豆油被認(rèn)為是CPC 合成期間的最佳碳源，并且豆油能夠激活交替呼吸途徑，加快NADH 的周轉(zhuǎn)速率，提高CPC 合成過程的能量供應(yīng)，從而更有利于CPC 的高產(chǎn)。然而近期Li 等[8] 通過研究豆油在不同發(fā)酵階段的代謝分析，首次發(fā)現(xiàn)了CPC 合成期間僅僅采用豆油會導(dǎo)致NADPH 和ATP 利用的不經(jīng)濟性，可能影響CPC 的發(fā)酵水平進一步提升，表明該策略存在優(yōu)化空間。

本文以頂頭孢霉菌為研究對象，首次成功開發(fā)了更適用于CPC 發(fā)酵合成過程的葡萄糖和豆油復(fù)合底物補料新策略，顯著提升了CPC 的合成速率，與僅采用豆油補料相比，CPC 發(fā)酵水平提升了14.8%。底物對次級代謝物合成的調(diào)控是個古老但未充分理解的課題[9]，本文從宏觀代謝研究、代謝物水平、代謝流、還原力和能量水平進行了系統(tǒng)解析，這也對其他次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵過程中的碳代謝調(diào)控具有重要的啟示意義。