一種檢測家禽配合飼料中蛋白同化激素的高效液相色譜-串聯質譜方法

摘 要：本文基于高效液相色譜-串聯質譜法建立了一種高精密度檢測家禽配合飼料中蛋白同化激素的方法，并對所建立的方法進行了方法學的考察與驗證。基于現存研究對前處理步驟進行了優化，并采用高效液相色譜-串聯質譜進行分析。睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的標準曲線相關系數分別為0.997 143、0.999 041、0.994 270、0.999 698，方法檢出限分別為2.26、2.29、2.78、2.34 μg/kg，回收率為89.0％～101.3％、87.5％～107.0％、91.0％～107.0％、86.5％～102.0％，相對標準偏差為1.1％～4.1％、3.0％～4.2％、2.7％～4.1％、2.2％～4.3％。結果表明，該方法檢出限低，回收率較好，同時精準度高，重復性好，可以為檢驗家禽配合飼料中蛋白同化激素提供有力的方法支撐。

關鍵詞：蛋白同化激素；高效液相色譜-串聯質譜；精密度；回收率

中圖分類號：TS252.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）05-0062-04

蛋白同化激素（anabolic androgenic steroids）是同化類固醇，是雄性化作用減弱而蛋白同化作用增強的甾體激素，主要種類包括睪酮衍生物（睪酮、勃地龍等）、雄烷衍生物（美雄酮、雄烯二酮等）、諾龍衍生物（諾龍、丙酸諾龍等）、雜環衍生物和雜類合成類固醇（美倫孕酮、黃體酮等）五大類[1]。這些物質具有相似的生理功能，但其M/A分化指數（M表示同化作用，A表示雄性激素活性）存在差異，M/A分化指數越高，同化作用相對越強[2]。蛋白同化作用可促進蛋白質合成，減少蛋白質分解，從而使肌肉和體重增加，同時促進鈣、磷吸收，加速骨鈣化；此外，還可以刺激生成促紅細胞生成素，促進血細胞的生成以及加速傷口愈合[3-4]。由于具有以上作用，蛋白同化激素被不法商家非法添加在畜禽飼料中以提高肉類產品的產量，含有這些激素的農產品被人攝入后在體內遷移蓄積，長期食用會導致性功能異常、肝功能障礙、內分泌紊亂，甚至誘發心血管疾病，從而對人體健康產生長遠的不良影響[3，5]。因此，檢測飼料中蛋白同化激素的含量對保障畜禽產品質量安全、維護人體健康有著重要意義。

目前蛋白同化激素的檢測方法主要有高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）、氣譜法、免疫分析法等[6-7]。其中高效液相色譜-串聯質譜法結合了色譜的良好分離能力與質譜的高特異性檢測特點，可實現對多種物質的同時測定，適用于復雜生物樣本的分析檢測。然而，使用高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中蛋白同化激素的相關研究較少[8-9]。

因此，本研究以家禽配合飼料為樣本，建立簡便、快速、可重復性高的前處理，采用高效液相色譜-串聯質譜法對樣本中的睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍這4種蛋白同化激素進行定性定量檢測，以期為蛋白同化激素的檢測提供有力的技術參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Aglient 1290超高效液相色譜儀，AB Sciex Triple Quad? 5500質譜儀，OAN-EVAP 24型全自動氮吹儀，TAITEC Mix-VR多管漩渦混合儀，梅特勒AG285型天平，IKAKS501型旋渦混合器，Sigma 3K15冷凍離心機，Millipor超純水儀，研磨機。

1.2 試劑

乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），甲酸（色譜純），0.1％（體積分數）甲酸溶液。

1.3 樣本制備

取適量家禽配合飼料，用組織搗碎機搗碎，放入潔凈容器作為試驗樣本，密封并標記，常溫保存。

1.4 標準溶液的配制

稱取睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的標準樣本，用甲醇分別配成1 000 μg/mL的標準樣本儲備液，－20 ℃冰箱中保存，有效期12個月；分別取4種1 000 μg/mL的蛋白同化激素標準樣本儲備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/mL 混合標準溶液，－20 ℃冰箱中保存，有效期 6個月；再取100 μg/mL混合標準溶液稀釋為10 μg/mL的混合標準樣本工作液。

1.5 樣本前處理

稱取5.00 g均質試驗樣本，置于50 mL離心管中，加入5 g碾磨小珠和乙腈20 mL。 10 000 r/min快速碾磨30 s后，6 000 r/min離心10 min，上清液轉移至50 mL梨形瓶中，在40 ℃水浴下氮氣吹干，用乙腈（含0.1％甲酸）1.0 mL溶解殘渣，渦旋45 s后過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.6 HPLC-MS/MS條件

1.6.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相A相為0.1％甲酸水溶液；流動相B相為甲醇；色譜柱溫度為40 ℃；進樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表1。

1.6.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描方式為負離子掃描；檢測方式為多反應監測；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度600 ℃；氣簾氣壓力為28 psi；碰撞氣壓力為10 psi；霧化氣壓力為55 psi；輔助加熱氣壓力為60 psi。

定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表2。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

按方法條件設置儀器參數，配制一系列濃度的標準樣本溶液（1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL），待儀器參數穩定后，對系列標準樣本溶液進行測定，繪制標準曲線。睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的相關系數為0.997 143、0.999 041、0.994 270、0.999 698，具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白家禽配合飼料樣本為基質，做7個平行添加試驗，陽性添加濃度睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍均為20 μg/kg，按照1.5方法進行前處理和上機測定，測得睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的方法檢出限分別為2.26、2.29、2.78、2.34 μg/kg，具體見表3。計算公式如下：

檢出限（μg/kg）= K·Sb·C/X

式中：K取3；Sb為平行測試樣含量的標準偏差；C表示加標濃度，μg/kg；X指平行試樣含量的平均值。

2.3 回收率及精密度確定

以空白家禽配合飼料樣本為基質，向家禽配合飼料樣本中添加蛋白同化激素（睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍）濃度水平分別為20.0、40.0、200.0 μg/kg進行加標回收試驗。按照方法進行前處理，上機測試，結果見表4和表5。

根據表4與表5中相對標準偏差和回收率結果可發現，該方法的相對標準偏差較低，且回收率表現較好，睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的回收率分別為89.0％～101.3％、87.5％～107.0％、91.0％～107.0％、86.5％～102.0％，相對標準偏差為1.1％～4.1％、3.0％～4.2％、2.7％～4.1％、2.2％～4.3％。該方法的檢出限較低、同時重復性較好，并且能保持較為優異的回收率，可用于睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍的準確定性、定量檢測。

3 結論

本文旨在建立一種基于高效液相色譜-串聯質譜的檢測家禽配合飼料中蛋白同化激素簡便測定方法，為相關行業檢測工作提供該類激素的檢測方法及檢測技術參考。結果表明，此方法前處理簡單，精密度高而且穩定性好，較大地提高了檢測效率，適用于家禽配合飼料中睪酮、勃地龍、美雄酮及諾龍殘留量的定性、定量檢測。

參考文獻

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作者簡介：龐李艷（1991－ ），女，本科，主要從事動物疫病預防控制相關工作；E-mail：348776239@qq.com共同第一作者：次仁玉珍

*通信作者：韓銀濤（1982－ ），男，高級獸醫師張秋韻