近紅外二區(qū)小分子有機探針I(yè)R-PEG-FA在肝癌術中導航中的應用

摘要：目的" 探討近紅外二區(qū)（NIR-II）小分子有機探針I(yè)R-PEG-FA（IPF）在肝癌術中導航的應用潛力，并進行體內近紅外熒光（NIRF）成像研究和體內外生物安全性評估。方法" 在課題組的研究基礎上，通過化學合成方法構建一種靶向肝癌特異性生物標志物的NIR-II小分子有機探針。用MTT法檢測該納米探針對肝癌細胞株BEL-7402、HepG-2、HuH-7及正常肝細胞HL-7702活性的影響；通過溶血實驗、急性毒性實驗和血生化檢測對納米探針的體內生物相容性進行評估；建立小鼠原位肝癌模型，分為IPF實驗組、IP對照組、生理鹽水對照組，實驗組尾靜脈注射IPF，對照組尾靜脈分別注射IP和生理鹽水，隨后利用NIR-II窗口成像技術檢測其納米探針I(yè)PF的特異腫瘤靶向性；最后在NIRF操作窗口下進行實時導航切除肝細胞腫瘤。結果" 納米探針I(yè)PF對BEL-7402、HepG-2、HuH-7及HL-7702細胞無明顯毒性，溶血率均低于3 %的安全限度，未引起顯著紅細胞損傷；急性毒性實驗中小鼠無異常行為和死亡情況，且對各重要臟器（心、肝、脾、肺、腎）正常結構和功能未產(chǎn)生明顯影響；小鼠肝功和腎功血生化指標均在正常范圍內；利用IPF納米探針進行肝腫瘤細胞標記，在NIRF窗口下觀察到肝癌細胞的熒光信號，手術后切除區(qū)域的熒光信號消失。結論" NIR-II小分子有機探針I(yè)PF具有良好的細胞安全性、優(yōu)異的生物相容性，能夠高效地標記肝癌細胞，具備肝癌術中導航潛力，能夠為肝癌治療的相關研究提供借鑒。

關鍵詞：肝細胞癌；近紅外二區(qū)熒光成像；肝切除術；術中導航

NIR?II small molecule organic probe IR?PEG?FA for intraoperative navigation in hepatocellular carcinoma

XU Yuye1， GAO Qin2， LI Ke3， WANG Yafei1， CHENG Zihe3， DONG Chuyu1， WANG Kexin1， PAN Qi1， 2

1The Second Clinical Medical College of Xi'an Medical College， Xi'an 710000， China; 2Department of Medical Imaging， The Second Affiliated Hospital， Xi'an Medical University， Xi'an 710038， China; 3Institute of Basic and Translational Medicine， Xi'an Medical College， Xi'an 710021， China

Abstract： Objective To explore the potential of IR-PEG-FA （IPF）， a near-infrared two-region （NIR-II） small-molecule organic probe， for intraoperative navigation in hepatocellular carcinoma and to perform in vivo near-infrared fluorescence （NIRF） imaging studies and ex vivo and in vivo biosafety assessments. Methods Based on the research of the group， a NIR-II small molecule organic probe targeting specific biomarkers of hepatocellular carcinoma was constructed by chemical synthesis. The effects of the nanoprobe on the activities of hepatocellular carcinoma cell lines BEL?7402， HepG?2， HuH?7 and normal hepatocytes HL-7702 were detected by MTT assay; the in vivo biocompatibility of the nanoprobe was evaluated by haemolysis assay， acute toxicity assay and blood biochemistry assay; the in situ hepatocellular carcinoma model was established in mice， and divided into IPF experimental group， IP control group and saline control group. The experimental group was injected with IPF in the tail vein， and the control group was injected with IP and saline in the tail vein， and the specific tumour targeting of their nanoprobe IPF was subsequently detected by using NIR-II window imaging; finally， real-time navigational resection of hepatocellular tumours was performed under the NIRF operation window. Results The nanoprobe IPF has no obvious toxicity to BEL-7402， HepG-2， HuH-7 and HL-7702 cells， and the haemolysis rate is below the safety limit of 3%， and it did not cause any significant erythrocyte damage; there is no abnormal behaviour or death of the mice in the acute toxicity test， and there is no obvious effect on the normal structure and function of the important organs （heart， liver， spleen， lungs and kidneys）; the liver and kidney functions of mice are all within the normal range. Using IPF nanoprobes for liver tumour cell labelling， the fluorescent signals of hepatocellular carcinoma cells were observed under the NIRF window， and the fluorescent signals in the resected area disappeared after the surgery. Conclusion NIR-II small molecule organic probe IPF has good cell safety， excellent biocompatibility， and can efficiently label hepatocellular carcinoma cells， possessing the potential of intraoperative navigation in hepatocellular carcinoma， which provides an idea and a reference for the research related to hepatocellular carcinoma treatment.

Keywords： hepatocellular carcinoma; near-infrared II fluorescence imaging; hepatectomy; intraoperative navigation

肝細胞癌（HCC）在全球惡性腫瘤中位列第四，也是導致癌癥死亡的第3大原因［1， 2］ 。我國HCC新發(fā)病例和死亡人數(shù)均居世界之首［3， 4］。根據(jù)《中國原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2022年版）》HCC診療指南，根治性切除術是HCC潛在治愈手段［5］。然而如何精準區(qū)分腫瘤與正常組織的邊界是肝癌手術一大挑戰(zhàn)，因其關系到能否徹底切除腫瘤的同時保留足夠的肝功能，進而減少術后的不良反應和復發(fā)風險［6］。目前，超聲、CT和MRI是診斷HCC的首選方法，但仍對3 mm以下的微轉移病灶及切緣肝癌細胞殘余的檢測效果并不理想［7］。微轉移病灶和陽性切緣是HCC術后復發(fā)的主要因素［8， 9］。因此，提高對這些小病灶的檢測能力對于降低HCC復發(fā)率至關重要［10］。

隨著光學診療技術的發(fā)展，近紅外熒光（NIRF）成像技術憑借其無創(chuàng)、實時、敏感度高的優(yōu)勢，在肝癌導航手術中得到廣泛的應用［11， 12］。相較于NIR-I，NIR-II的熒光成像技術展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，包括更深的組織穿透力、更低的自然組織自發(fā)熒光干擾以及更高的空間分辨率［13］。這些特性使得NIR-II成像在肝癌手術導航切除中能夠提供更為精確的腫瘤邊界信息，極大促進了肝癌的早期檢測和精確切除，展現(xiàn)了其在腫瘤診斷和手術導航方面的巨大潛力［14］。值得注意的是，NIR-II有機小分子熒光探針的發(fā)展為手術導航帶來了新的機遇［15］。吲哚菁綠（ICG）作為已獲臨床批準的小分子熒光染料，在NIR-II成像領域的臨床研究中受到了廣泛關注［16］。研究表明，使用ICG染料進行的NIR-II成像在信噪比和分辨率方面優(yōu)于NIR-I成像［17］；有學者開發(fā)的可見光/NIR-I/NIR-II多光譜成像儀，使用ICG成功指導了首例NIR-II熒光成像技術引導下的肝癌切除手術［18］。然而，由于缺乏腫瘤特異性靶向性和較短的瘤內滯留時間，仍存在假陽性的風險［19］，這限制了ICG的臨床應用。有研究通過ICG標記人源化抗GPC3單克隆抗體，開發(fā)NIR-II熒光探針GPC-ICG靶向肝細胞癌［20］。有研究設計了一種含有PDA-CaCO的特定腫瘤微環(huán)境刺激激活的NIR-II納米探針（DSNCs@hPCa）上并在空心表面上偶聯(lián)葉酸（FA）分子靶向肝癌［21］。但既往開發(fā)的探針對檢測早期小肝癌的能力、在深部組織中的應用效果、在體內長期毒性和生物相容性等方面未能充分研究。因此，當前迫切需要構建一種高特異靶向性、組織穿透效果強、生物安全性好的肝癌NIRF探針，以實現(xiàn)術中實時定位腫瘤邊界和發(fā)現(xiàn)微小病灶，從而實時引導手術。

本研究在團隊前期開發(fā)的“S-D-A-D-S”型NIR-II探針I(yè)R-PEG的基礎上［22］，通過在其表面修飾具有靶向性的葉酸分子，旨在構建一種靶向肝癌特異性生物標志物的NIR-II小分子有機探針I(yè)PF，驗證IPF探針的細胞安全性和生物相容性，并使用肝癌動物模型進行NIRF成像，以評估其在術中導航切除中的應用效果，以期提高肝癌術前診斷準確性和術中切除精確性，從而為肝癌手術治療提供一種精準的導航技術。

1" 材料與方法

1.1" 新型探針的制備

采用本研究團隊合作單位南華大學衡陽醫(yī)學院分子影像探針實驗室的前期合成技術［22］制備IPF探針。首先，將化合物IR-FE（濃度為0.1 mmol/L）和疊氮化鈉按1：10溶解在4.5 mL的DMF中。將溶液于70℃加熱攪拌5 h。用乙酸乙酯進行兩次萃取并通過旋蒸得到粗產(chǎn)物（IR-FE-N3）。然后將40 mg IR-FE-N3與76 mg DBCO-PEG-FA于4 mL的DMF中反應3 h，離心洗滌。最后將得到的產(chǎn)物通過PD-10柱進行純化，獲得純凈的IR-PEG-FA （IPF）納米探針，IPF的結構（圖1）。

1.2" 細胞毒性研究

取對數(shù)生長期的3種肝癌細胞株（BEL-7402、HepG-2、HuH-7）和HL-7702正常肝細胞，常規(guī)消化處理后制成細胞懸液，并分別接種于96孔板中。隨后，將接種好的96孔板置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待細胞貼壁生長24 h后，棄去孔內的培養(yǎng)液。然后在每孔中加入不同濃度的樣品溶液：IPF組（81、27、9、3、1、0 μg/mL）、FA組（9、3、1、0.33、0.11、0 μg/mL）、DOX組（1、0.33、0.11、0.04、0.01、0 μg/mL）。將96孔板置入培養(yǎng)箱中孵育48 h后取出棄去培養(yǎng)液，每孔中加入90 μL完全培養(yǎng)基，然后加入10 μL CCK-8溶液，并再次培養(yǎng)2 h。之后，使用酶標儀測定各孔在450 nm波長下的吸光度值A450 nm，以此評估納米探針對細胞的潛在毒性。按公式計算各組細胞存活率：細胞存活率（%）=（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。每組設置3個平行樣本。

1.3" 體內生物相容性評估

1.3.1" 溶血測試" "制備2%的紅細胞懸液，分為3組：實驗組向細胞懸液中分別加入IPF和FA溶液，陽性對照組中分別加入0.1% Triton X-100和蒸餾水，陰性對照組中加入等量生理鹽水，將其充分混合后置于放入37 °C恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，置于離心機（10 000 r/min，20℃）離心3 min，然后用等體積的蒸餾水替換上清液，再將其放入恒溫保溫箱中繼續(xù)孵育4 h，使用微孔板分光光度計測量各組在540 nm波長處的吸光度OD值，并通過測得吸光度值OD按照以下公式計算溶血率，驗證納米探針是否會引起紅細胞溶解反應。

[Hemolysisratio%=ODsample?ODnegative controlODpositive?ODnegative control]

1.3.2" 急性毒性測試" "隨機選取12只體質量約為35 g的昆明白雄性小鼠，將其分為IPF實驗組和生理鹽水對照組，6只/組。IPF實驗組將樣品IPF濃度稀釋至0.75 mg/mL，通過尾靜脈注射（200 μL/只）給藥，生理鹽水對照組通過尾靜脈注射生理鹽水（200 μL/只）。注射前6 h小鼠禁食禁水，注射后觀察2 h。連續(xù)14 d觀察小鼠有無異常行為，并計算存活率。14 d后對存活小鼠實施安樂死，取各組小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺、腎）制備組織切片，并進行HE染色以進行組織學分析。本研究動物實驗經(jīng)西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理審批號：X2Y202418）。

1.3.3" 血生化分析" "隨機選取12只體質量約為35 g的昆明白雄性小鼠，將其分為IPF試驗組和生理鹽水對照組，6只/組。IPF實驗組將樣品IPF濃度稀釋至0.75 mg/mL，通過尾靜脈注射（200 μL/只）給藥，生理鹽水對照組通過尾靜脈注射生理鹽水（200 μL/只）。注射48 h后，采集小鼠眼眶血樣送至實驗室檢測其谷丙轉氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酐（CREA）和尿素（UREA）含量，并對檢測結果進行數(shù)據(jù)分析。

1.4" 原位肝臟腫瘤模型構建

選取2只雄性BALB/c小鼠進行皮下瘤模型的建立，收集已培養(yǎng)的BEL-7402細胞，計數(shù)調整為每200 μL里包含1×107個細胞，每只小鼠右側胯部皮下注射200 μL細胞懸液。待小鼠的皮下瘤生長到直徑約為0.7 cm時，用于原位肝癌模型的建立。隨機選擇20只雄性BALB/c小鼠進行原位肝臟腫瘤模型的建立。無菌條件下提前剖取皮下瘤，用手術刀片將其切割至約1 mm3大小，并浸泡在DEME培養(yǎng)基溶液中，存放在冰盒中備用。異氟烷氣體麻醉備皮小鼠，將其仰臥位固定于預先消毒好的手術臺上。使用0.2%碘伏充分消毒小鼠腹部， 并鋪蓋一次性洞巾，上至胸部，下至會陰部。在其劍突右下側1 cm處行垂直切口，長度為1 cm，依次切開皮下組織及其腹膜，期間觀察有無出血并注意及時用棉簽壓迫止血，用牽開器擴張傷口，打開腹腔、暴露肝。使用無菌棉簽將肝左葉輕柔卷出，以10 mL注射器的針頭以15 °角刺肝被膜，深度約0.6 cm，無菌棉簽壓迫8 s止血，取上述一塊1 mm3瘤塊組織，用5 mL注射器針頭經(jīng)創(chuàng)口植人裸鼠肝左葉被膜下，用電凝刀粘合傷口。將腹膜和皮膚傷口進行消毒縫合后，待小鼠清醒后置于干凈的籠子中觀察，每日進行傷口消毒并給予高營養(yǎng)飼料。

1.5" 原位肝臟腫瘤熒光成像

隨機選取2只建模成功的原位肝癌小鼠尾靜脈注射納米探針I(yè)PF（200 μL/只），分別在0、6、12、24、36、48 h進行NIR-II熒光成像（異氟烷吸入麻醉），監(jiān)測肝臟腫瘤部位的熒光信號變化。

1.6" 原位肝臟腫瘤外科切除

將18只成功建模的原位肝癌小鼠隨機分為3組：IPF實驗組、IP對照組、生理鹽水對照組，6只/組。分別于術前3 d、術前1 d、手術當天、術后10 d對小鼠進行NIR-II熒光成像（異氟烷吸入麻醉），每次成像前約1 d分別進行尾靜脈注射納米探針I(yè)PF、IP和生理鹽水（200 μL/只），以定位肝臟腫瘤的熒光信號。

在建模后第6天，將各組建模小鼠用異氟烷氣體進行持續(xù)麻醉，固定在預先消毒好的手術臺上，仰臥位固定小鼠四肢。使用0.2%碘伏對小鼠腹部進行充分消毒，并鋪蓋一次性洞巾，覆蓋范圍從胸部到會陰部。沿原先的建模傷口依次切開皮膚、皮下組織和腹膜，注意觀察有無出血并用棉簽及時壓迫止血，使用牽開器擴張傷口。使用無菌棉簽輕柔地將肝臟腫瘤組織卷出，并用掛線懸吊其尖端。在NIRF操作窗口導航下，使用電凝刀切除熒光信號部分的組織。最后對腹膜和皮膚傷口進行消毒縫合，待小鼠清醒后置于干凈的籠子中觀察，每日進行傷口消毒并給予高營養(yǎng)飼料。

1.7" 統(tǒng)計學分析

采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有實驗至少重復3次，所有符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" "結果

2.1" 細胞毒性測試結果

MTT檢測結果顯示BEL-7402（圖2A）、HepG-2（圖2B）、HuH-7（圖2C）、HL-7702（圖2D）在所測試的濃度范圍內，均未表現(xiàn)出顯著的細胞毒性作用。在人正常肝細胞HL-7702中，以DOX作為陽性對照，即使IPF處理組濃度為其81倍時，仍保持了70%以上的細胞存活率，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.001），對正常肝細胞活力無顯著影響。在各個處理組別內（IPF、FA、DOX）對肝細胞的毒性略均隨濃度的增加而增大，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性增強，但IPF整體呈現(xiàn)較低的細胞毒性。

2.2" 生物相容性測試結果

溶血實驗結果顯示，陽性對照組的溶血率約為96%，陰性對照組的溶血率為1.09%，納米探針I(yè)PF及其主要成分FA均未引起顯著的紅細胞損傷，溶血率均低于3%的安全限度（圖3A）。急性毒性實驗14 d中實驗小鼠無異常行為和死亡情況（圖3D），且HE染色切片顯示對小鼠各重要臟器心肝脾肺腎的正常結構和功能未產(chǎn)生明顯影響，無明顯毒性跡象（圖3C）；檢測小鼠部分肝功腎功血生化指標，可以發(fā)現(xiàn)肝功能（ALT、LDH）和腎功能（CREA、UREA）指標均在正常范圍內（圖3B）。

2.3" 肝臟腫瘤熒光成像效果

在NIRF窗口下，小鼠尾靜脈注射納米探針I(yè)PF后，肝臟腫瘤中的熒光信號強度顯著高于周圍的健康肝組織。注射后的24 h內，肝臟腫瘤組織內熒光信號強度呈現(xiàn)出時間依賴性的增強趨勢，注射納米探針約24 h后，熒光信號強度達到峰值，隨著時間的推移，納米探針經(jīng)腎臟和肝臟的代謝排出體外，熒光信號強度進行性下降。注射后探針在肝臟腫瘤中的停留時間長達約48 h（圖4A）。

2.4" 近紅外窗口下實時引導手術切除

在NIRF成像窗口下，切除肝臟中顯示明亮熒光信號的區(qū)域，可以觀察到切除后組織的熒光信號強度顯著降低（圖4B）。比較IPF實驗組和IP對照組，發(fā)現(xiàn)IPF實驗組的熒光信號更為明顯，且腫瘤邊界更加清晰。

3" 討論

目前臨床上公認的HCC潛在治愈治療手段為手術切除，但術中僅憑外科醫(yī)生的視覺和觸診，往往不能準確切除微小病灶或者過度切除肝實質，而造成HCC患者術后早期復發(fā)或肝功能下降甚至衰竭［23， 24］。NIR-II熒光成像作為一種簡便、準確、安全的工具，在術前篩查診斷和術中實時導航展現(xiàn)出極大的優(yōu)勢［25， 26］，例如實時、操作簡便、敏感度高等。本研究基于此構建的NIR-II小分子有機納米探針I(yè)PF，通過體外實驗與體內實驗系統(tǒng)評估了其對肝細胞毒性、生物相容性和腫瘤靶向性，細胞毒性實驗中納米探針I(yè)PF在4種肝細胞系均表現(xiàn)出較低的毒性，溶血實驗中IPF及其主要成分FA均未引起顯著的紅細胞損傷，溶血率均低于3%的安全限度，急性毒性實驗中實驗小鼠無異常行為和死亡情況，且HE染色切片顯示對小鼠各重要臟器心肝脾肺腎無明顯毒性跡象，檢測部分肝腎功指標均在正常范圍內，影響可忽略。以上實驗結果證實IPF具有優(yōu)異的生物相容性和細胞安全性，而在NIRF窗口下IPF不僅能夠特異靶向積聚于肝臟表面病灶，同時也能檢測到切緣殘留小病灶，具有特異的腫瘤靶向性，有望實現(xiàn)肝癌病灶或切緣的精準定位。

通過熒光來檢測病灶是基于腫瘤周圍熒光組織與其他非熒光肝組織之間的對比，這意味著探針需要具備特異的腫瘤靶向性，從而實現(xiàn)對肝癌病灶或切緣的精準定位。ICG作為已經(jīng)通過美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的小分子熒光染料，研究表明，其在腫瘤組織中積聚主要是由于肝癌細胞的生物學特性，如高血流量、高代謝活性以及增強的血管生成能力等因素，而ICG本身并不特異靶向腫瘤［27］。而本研究構建的NIR-II小分子有機納米探針I(yè)PF，在肝臟腫瘤內產(chǎn)生強烈的NIR-II熒光信號，在注射24 h達到最大積累水平，隨后在腎臟和肝臟的代謝作用下被排出體外，熒光信號下降，這一結果表明納米探針I(yè)PF具有精準的腫瘤靶向性。此外，為了實現(xiàn)使用近紅外熒光進行術中精準成像的可行性，關鍵是要確保探針在體內的富集和滯留，保證在較長時間內可以對腫瘤進行實時成像，這對于需要長時間進行的復雜手術尤為重要。有研究構建的靶向小分子熒光探針SeCF3-IRD800的肝臟腫瘤熒光信號在注射后8 h時達到峰值。隨后因探針代謝清除而下降，注射后約24 h完全消失［7］。而本研究中納米探針I(yè)PF在應用于原位肝癌模型時，注射后探針在肝臟腫瘤中停留長達約48 h，這一特性為進行準確的圖像引導腫瘤切除手術提供了一個較寬的時間窗，為肝癌手術導航和切除提供了有力的技術支持。

本研究也存在局限性：本研究缺乏術后腫瘤標本病理結果，檢測手術切緣肝癌細胞是否殘余，可進一步評估納米探針I(yè)PF的腫瘤靶向和術中導航效果。組織穿透深度一直是光學成像中的一個挑戰(zhàn)［28］，深度增加常導致圖像分辨率下降、對比度減弱及信號強度減弱，影響深部腫瘤的成像質量和應用范圍。而使用NIR-II熒光成像技術結合其他成像方法（如光聲成像和MRI）的一些臨床前結果可以補償穿透深度和改善圖像分辨率［29， 31］，下一步可嘗試采用NIR成像結合MRI、光聲成像等多模態(tài)成像方法，有望提高臨床前期的腫瘤診斷準確性，實現(xiàn)肝癌切除術中實時導航，為未來肝癌診療技術發(fā)展帶來新的突破與進展。

綜上，本研究成功制備了一種靶向肝癌特異性生物標志物的NIR-II小分子有機探針I(yè)PF，探討了其在肝癌術中導航領域的應用潛力。IPF憑借其優(yōu)異的生物相容性和腫瘤靶向成像效果，為術中實時導航提供了更精準的成像手段，這一研究成果有望提高診斷準確性和手術精確性，也為肝癌治療的相關研究提供借鑒。

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（編輯： 林" 萍）

收稿日期：2024-04-26

基金項目：陜西省科技廳重點研發(fā)項目（2021SF-271）；陜西省教育廳服務地方專項（22JC056）；西安市科技局醫(yī)學研究一般項目（24YXYJ0188）；西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院院級課題（24KY0102，24KY0106，24KY0121）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃訓練項目（S202311840014，121524099）

作者簡介：徐鈺葉，在讀本科生，E-mail： 2268176652@qq.com

通信作者：潘" 奇，博士，副主任醫(yī)師，E-mail： 1287346579@qq.com