煙草NPR1基因家族鑒定及其在南方根結線蟲脅迫下的表達分析

摘要：本研究旨在挖掘煙草抗南方根結線蟲病程相關基因非表達子NPRJ（non-expressor of PR genes）家族成員，并明確其功能。基于擬南芥AtNPR1家族成員蛋白序列，利用生物信息學方法鑒定分析煙草NtNPRI基因家族成員及其特征。通過qRT-PCR檢測南方根結線蟲侵染后抗病（NC95）、感病（長脖黃）煙草品種NtNPRI家族重要候選抗性基因的相對表達量，采用LC-MS/MS方法對2個品種煙草根系內源水楊酸含量進行檢測。結果表明，從普通煙草基因組中共鑒定到12個NlNPRI基因，這些基因被分為3個亞組，同一亞組中NtNPRI家族成員蛋白結構、保守基序的長度和位置都極為相似。編碼氨基酸長度范圍為462～588，均為親水性蛋白，均位于細胞核。南方根結線蟲侵染抗、感煙草品種后，根系中水楊酸含量、NtNPR1基因家族成員表達量在抗病品種中均升高，在感病品種中則降低，其中NtNPR6的變化最為明顯。綜上，NPRJ基因與煙草南方根結線蟲抗性密切相關，NtNPR6基因可作為煙草響應南方根結線蟲脅迫的重要基因。

關鍵詞：煙草；NPR1基因家族；生物信息學分析；南方根結線蟲；表達分析

中圖分類號：Q781：S572 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）09-0022-12

煙草為我國重要的經濟作物，生產過程中受到各種病蟲害的危害，其中南方根結線蟲病是制約煙葉生產的一個主要因素，針對該病害的防治主要集中在生物、化學防治上，但并未從根本上解決問題。病程相關基因非表達子（non-expres-sor of PR genes，NPRl）是水楊酸SA信號轉導途徑下游的一類關鍵調控因子，也是SA的受體蛋白，在植物系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）及葉、花的形成發(fā)育過程中起著重要作用。目前，關于NPR1基因介導SA信號轉導途徑在南方根結線蟲脅迫下煙草相關轉運調控機制的研究較少。因此，挖掘煙草抗南方根結線蟲基因對抗性品種選育和病害防治具有重要意義和參考價值。

前人研究表明，在大豆中過表達NPRI基因能有效抑制寄生線蟲形成根癭、卵囊、卵和二齡幼蟲的能力。較野生型植株，AtNPR1轉基因煙草對南方根結線蟲表現出更好的抗性。抗病樹種毛白楊在感染歐美楊細菌性潰瘍病菌（Lonsdalea quercina subsp，populi）后體內NPRI-1、NPR1-2被誘導表達。Molla等通過在水稻中組織特異性表達AtNPR1基因發(fā)現，水稻對稻紋枯病的抗性顯著升高，表明該基因在植物抗性反應建立過程中起關鍵作用。外源茉莉酸（JA）和乙烯（EL）處理紅麻后，紅麻抗根結線蟲相關基因NPRI表達量均有提高，表明NPR1在JA/EL激素信號通路中被誘導表達，從而激活植物系統(tǒng)抗性（induced systenuc resistance，ISR）。NPR1作為兩條不同形式抗病信號轉導途徑的重要交匯中心之一，在SAR和ISR反應中具有重要調控作用，是植物抗性激活方面不可缺少的調控因子，且NPR1具有平衡JA/EL信號轉導途徑強弱的能力。在缺少NPRI的情況下，擬南芥nprl突變體植株對SAR誘導物無法應答，并且病程相關基因（pathogenesis related gene，PR）也幾乎不表達，導致植株對病原菌的防御力降低；相反，在NPRI存在時，SA信號轉導途徑介導的SAR反應過程中會產生關鍵調節(jié)因子，參與到PR基因表達調控，使植株抗性提升。

目前，在擬南芥（Arabidopsis thatiana）基因組中共鑒定出5個與NPR1具有高同源性的旁系基因，并將其分別命名為NPR2、NPR3，NPR4、NPR5（又稱為BOP2）、NPR6（又稱為BOPl）。有研究表明，擬南芥AtNPR1、AtNPR2在SA介導的免疫反應中具有正向調控作用：AtNPR3、AtNPR4在SA誘導的抗性基因表達過程中發(fā)揮反向調控作用；AtNPR5、AtNPR6對植物花、冠等器官發(fā)育與形成具有促進作用。經典的NPR1基因結構包含BTB/POZ（broad-complex，tramtrack，andbric-a-brac/poxvinls and zinc-finger）結構域、錨蛋白重復序列（ankyrin repeats，ANK-r）結構域以及NPRl-like-C轉錄激活結構。其中，BTB和ANK-r結構域與其他轉錄因子相互作用促使植物SAR反應建立。位于N端的BTB結構域通過介導NPR1與EIN3（乙烯受體蛋白）結合，使頂端彎鉤形成受阻。并且BTB結構域還可與TGA2抑制區(qū)相互作用抑制PR基因的表達，與本身C端相互作用抑制NPR1的表達，當C端通過Cu2+與SA結合后，又重新激活NPR1與TGA形成轉錄復合體，誘導PR基因表達。

隨著越來越多的植物全基因組測序工作的完成，不同植物的NPR1基因家族被陸續(xù)鑒定出來，如小麥、棉花、番木瓜和鱷梨中分別鑒定出1、1、4個和5個NPRI基因。煙草屬于經濟類模式作物，鑒定其NPR1基因家族對研究煙草抗性獲得以及響應生物脅迫調控等方面具有重要意義。本研究通過同源比對和生物信息學方法從普通煙草基因組中鑒定NPR1基因家族，并系統(tǒng)分析候選基因理化性質、物種進化關系、蛋白結構及在南方根結線蟲脅迫下的表達等特性，以期為明確煙草NPRI在響應脅迫過程中的調控機制提供理論指導。