毛頭鬼傘漆酶基因Cc_lac21的克隆及生物信息學(xué)和組織表達(dá)分析

摘要：為了確定毛頭鬼傘基因組中漆酶基因Cc_lac21的“缺口”序列及可能的生理功能，本研究對(duì)其進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，并以18S rDNA為內(nèi)參基因，檢測(cè)菌絲階段以及商品成熟階段子實(shí)體的菌蓋、菌柄頂端和菌柄基部Cc_lac21的表達(dá)水平。結(jié)果表明，Cc_lac21基因全長(zhǎng)2 243 bp，含有12個(gè)內(nèi)含子、13個(gè)外顯子，編碼序列為1 452 bp，編碼483個(gè)氨基酸。Cc_Lac21為穩(wěn)定的親水性蛋白，N端前17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，分泌到胞外；二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈為主；在28個(gè)絲氨酸（S）、21個(gè)蘇氨酸（T）和5個(gè)酪氨酸（Y）上可能發(fā)生磷酸化修飾；在第286位的蘇氨酸和第381位的絲氨酸處可能發(fā)生o-糖基化修飾；含有3個(gè)銅氧化蛋白結(jié)構(gòu)域，分別是2個(gè)銅氧化還原蛋白超家族（cupredoxin super family）和1個(gè)云芝Tv-LCC樣真菌漆酶的第三個(gè)銅氧化還原域（CuR0_3_Tv-LCC9）；與鱗白環(huán)蘑漆酶的親緣關(guān)系最近，包含3個(gè)基序。通過(guò)RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，Cc_lac21在菌絲體階段和成熟菌柄基部表達(dá)量高，在菌蓋和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的菌柄頂端表達(dá)量低，推測(cè)Cc_lac21可能參與基質(zhì)木質(zhì)素的降解以及菌柄中菌絲細(xì)胞壁的成熟過(guò)程。本研究結(jié)果可為探究漆酶基因參與菌柄細(xì)胞壁成熟機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：毛頭鬼傘；漆酶基因Cc_lac21；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q781：S567.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）09-0013-09

毛頭鬼傘（Coprinus comatus）又稱“雞腿菇”，屬于擔(dān)子菌門(mén)鬼傘科鬼傘屬真菌，是一種優(yōu)良食藥兼用菌，對(duì)農(nóng)作物秸稈有較強(qiáng)的降解能力，能夠分泌包括漆酶（laccase，E.C.1.10.3.2）在內(nèi)的木質(zhì)纖維素水解酶。漆酶屬于多銅蛋白家族，因最早從日本漆樹(shù)（Rhus verniajluo）分離到而得名，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和昆蟲(chóng)等各種生物體中，具有氧化多種芳香族和非芳香族化合物的能力，包括取代酚類化合物、一些無(wú)機(jī)離子和多種非酚類化合物，能對(duì)酚類物質(zhì)進(jìn)行單電子氧化，并利用氧作為最終的電子受體，生成副產(chǎn)物水。相比于細(xì)菌漆酶，真菌漆酶具有更高的氧化還原電勢(shì)，生物學(xué)功能多樣，因而備受青睞。如：真菌漆酶可以降解酚類、非酚類木質(zhì)素相關(guān)化合物為高度耐降解的物質(zhì)，有利于酚類物質(zhì)清除：還可以對(duì)工業(yè)紡織廢水進(jìn)行脫色和解毒，從而有助于廢水的生物修復(fù)。Clark等以昆蟲(chóng)為反應(yīng)器對(duì)真菌漆酶進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)工業(yè)污染物的原位生物修復(fù)。球孢白僵菌（Beauceria bassiana）漆酶BbLac2參與卵孢菌素合成，在逃避昆蟲(chóng)免疫反應(yīng)中扮演了多功能角色。柑橘漆酶CsLAC6可能與褐斑病的發(fā)生有關(guān)，其表達(dá)量上調(diào)對(duì)柑橘果皮褐斑的形成起促進(jìn)作用。一色齒毛菌（Cerrena unicolor）漆酶Lac5具有較好的耐熱性且對(duì)黃曲霉毒素B1（AFB1）有良好的降解效果。此外，漆酶還參與真菌的生物合成、木質(zhì)素降解、子實(shí)體形態(tài)發(fā)生等過(guò)程。

隨著越來(lái)越多菌物基因組被解析，大量的食藥用真菌的漆酶基因被研究報(bào)道，如皺木耳（Auricularia delicata）、荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes）、平菇（Pleutoms ostreatus）、杏鮑菇（Pteurotus eryngii）和松杉靈芝（Ganoderma tsugae）、楊樹(shù)菇（Agrocybe aegerita）、草菇（Volvariella volvacea）、云芝（Trametes versicolor）等。在毛頭鬼傘中，Bao等克隆了毛頭鬼傘漆酶基因lac1和lac2并在畢赤酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)，它們分別編碼517個(gè)和523個(gè)氨基酸：之后Gu等克隆了毛頭鬼傘的另外2個(gè)漆酶基因lac3和lac4，它們分別編碼547個(gè)和532個(gè)氨基酸。

但當(dāng)前美國(guó)生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中毛頭鬼傘的基因組數(shù)據(jù)ASM331602vl（登錄號(hào)：GCA_003316025.1）還是一個(gè)“草圖”結(jié)果，不僅缺少注釋信息，而且含有很多缺口，Contig N50值僅為17 206 bp，組裝質(zhì)量較差。前期基于此毛頭鬼傘基因組數(shù)據(jù)，我們預(yù)測(cè)到至少21個(gè)漆酶基因，包括Cc_lac21，但基因序列中有大量不確定的堿基信息，未能確定其氨基酸序列。基于此，本研究中我們?cè)O(shè)計(jì)特異性引物克隆Cc_lac21的全長(zhǎng)序列，并填補(bǔ)“缺口”序列，然后對(duì)其開(kāi)展生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)其在毛頭鬼傘不同發(fā)育階段子實(shí)體不同部位中的表達(dá)情況，以期為闡明Cc_lac21在毛頭鬼傘生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生理功能以及開(kāi)發(fā)利用毛頭鬼傘漆酶等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株和引物

毛頭鬼傘QLKL-01菌株通過(guò)標(biāo)本QLS20170822002（采自祁連山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)康樂(lè)自然保護(hù)站，東經(jīng)99.876709°，北緯38.905996°）組織分離獲得，現(xiàn)保藏于河西學(xué)院祁連山菌物活體組織庫(kù)。所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司（簡(jiǎn)稱生工生物公司）合成，其中，基因克隆引物（lac2/F：5’-ATGCTGTCCTCT-GCCCTCCT-3’：lac21R：5’-CTAGAA，ITCTGGAAGATAGTCAATATAGCTAG-3’）基于之前l(fā)ac21的生物信息預(yù)測(cè)序列使用Vazyme公司的CE Design軟件設(shè)計(jì)，RT-qPCR分析所需漆酶基因lac21引物（lac2/qF：5’-GACACAAGITITCCCACGCC-3’：/ac2/qR：5’- CAGTGGTCTCGCTGTTGTCT -3’）和內(nèi)參基因18S rDNA引物（18S rDNAF：5’- AAACGGCTACCACATCCA-3’；18SrDNAR：5’-CAC-CAGACITGCCCTCCA-3’）均采用NCBI PrimerBlast在線設(shè)計(jì)。