粉葛PtERF98基因克隆及表達分析

摘要：乙烯響應因子（e山ylene responsive facLor，ERF）是植物特有的一類轉錄因子，在乙烯信號轉導通路、植物生長發育和逆境脅迫響應中起重要的調控作用。為探明PLERF98轉錄因子在粉葛（Pueraria thomsonii Benth.）塊根采后生理性變質（posL-harvesL physiological deIerioration，PPD）過程中的表達調控機制，本研究采用RT-PCR技術從火山粉葛葉組織中克隆PtERF98基因，并對其進行生物信息學、組織表達特異性分析和在PPD過程中的表達分析。結果顯示，PtERF98基因CDS序列長450 bp，編碼149個氨基酸殘基，PIERF98蛋白理論分子量為16.93 kDa，理論等電點為8 06，為親水性不穩定蛋白。蛋白結構分析顯示，PtERF98具有典型的AP2保守結構域，屬于ERF轉錄因子家族成員，定位于細胞核，無跨膜螺旋結構，含有1個信號肽和16個磷酸化位點。氨基酸序列同源性和系統進化關系分析表明，PtERF98與大豆（Clycine max）CmERF98同源性最高且親緣關系最近。組織表達分析顯示，PtERF98基因在火山粉葛的根、莖、葉中均有表達，且在不同組織中的相對表達量存在差異，葉中表達量最高。此外，PtERF98的表達受到PPD的顯著誘導，表達水平隨著PPD時間延長呈先升高后下降趨勢，并在采后48 h達到最高，推測該基因可能參與粉葛塊根的PPD過程。本研究可為深入了解PtERF98基因的功能及其在粉葛PPD過程中的表達調控作用奠定研究基礎。

關鍵詞：粉葛；乙烯信號通路；PIERF98轉錄因子；采后生理性變質；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號：Q781：S567.9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）09-0006-07

粉葛（Pueraria thomsonii Benth.）是豆科蝶形花亞科葛屬藤本植物，在我國廣泛分布。它的莖基部木質化，并帶有肥厚的塊狀根。研究發現，粉葛含有多種活性成分，主要包括葛根素、大豆苷元、染料木素、異甘草素等異黃酮類化合物，以及皂角精醇、槐二醇、大豆苷醇等皂苷類物質。火山粉葛是中國國家地理標志產品之一，因生長在廣東省韶關市曲江區大塘鎮火山地區而得名。與其他產地的粉葛相比，火山粉葛具有肉質根，口感綿軟細嫩，味道甘甜，淀粉含量高，水分和纖維含量低，素有食不留渣的優越品質。作為一種“藥食同源”作物，火山粉葛具有保護心腦血管系統、降血糖和血脂、抗腫瘤、抗氧化、解酒等生物活性。此外，火山粉葛富含優質蛋白質、多糖及多種微量元素，不僅可以作為美食，還有清熱、養肝、理氣、養顏等醫用功效，具有極高的食用價值和保健價值。同時植株還具有耐寒、抗旱和耐貧瘠等特性，是一種具有巨大發展潛力的綠色能源植物。然而，粉葛的塊根在采收后2-3 d便會發生腐爛霉變等采后生理性變質（post-harvest physiological deterioration，PPD）現象，嚴重制約它的貯藏、加工、運輸和利用。因此，研究粉葛PPD的分子機制對于粉葛產業的可持續發展具有重要意義。

乙烯（2-chloroethylphosphonic acid）是植物重要的內源激素，對植物的生長發育和非生物脅迫響應起重要作用。例如，在植物缺水時，乙烯水平迅速升高，以促進植物葉片老化和脫落，維持植物體內水分平衡。乙烯前體處理能顯著提高擬南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗在高鹽脅迫下的存活能力。此外，乙烯信號與活性氧含量變化的相關性也得到研究證實。在皇冠梨（Pyrus bretschneideri）中，乙烯通過提高過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性來抑制采后腐爛。擬南芥中的乙烯信號轉導通路的關鍵成員包括乙烯受體（ethylene receptors）、CTR1蛋白激酶（Raf-like CTRl）、EIN2（ ethylene insensitive 2）、EIN3（ethylene insensitive 3）/EILl（ethylene insensitive like l）、ERFl（ ethylene response factor l）以及EBFl/2（EIN3 binding F-box l and 2）等。作為乙烯信號途徑中的核定位轉錄因子，ERF（ethylene responsive factor）轉錄因子屬于具有典型ERF結構域的AP2/ERF轉錄因子大家族。ERF98是ERF家族的重要成員，在多種非生物脅迫應激反應中發揮調控功能。例如，擬南芥AtERF98通過調控維生素C合成關鍵基因的表達，增強維生素C的合成能力，以清除鹽脅迫下積累的活性氧，提高鹽脅迫的耐受性。桃樹（Prunus persica）的PpERF98與PpERFl相互作用，共同介導茉莉酸／乙烯信號途徑中的ERF分支，從而負調控桃樹對流膠病菌（Lasiodiplodia theobromae）的抗性。然而，目前有關粉葛ERF轉錄因子的研究鮮有報道。

以往的研究顯示，活性氧積累是塊根類作物發生PPD的根本原因之一，而酶促褐變是PPD過程中最為明顯的表現，其誘因是細胞組織中原有的酚類物質被氧化成醌類化合物進而聚集形成褐色或黑色物質。課題組前期研究顯示，乙烯處理能夠通過提高抗氧化系統相關基因的表達來提升抗氧化酶的活性，繼而顯著抑制火山粉葛PPD進程，但響應機制尚不明確。因此，本研究基于前期火山粉葛轉錄組數據分析，從火山粉葛葉組織中克隆PtERF98基因編碼區（CDS）序列，并對其進行生物信息學和組織表達特異性分析，以明確該基因在PPD不同階段的表達模式，為深入研究PtERF98基因功能及其在粉葛PPD過程中的分子調控機制提供基礎，也為通過現代育種技術培育火山粉葛優良品種提供基因資源。