熒光顯微鏡與流式細胞儀融入醫學實驗技術專業實驗教學探究

摘 要 針對構建多層次實驗教學平臺、改進實驗教學方法以及豐富實驗教學內容等教學改革問題，將大型儀器的使用與醫學實驗技術專業本科生實驗教學相融合，優化實驗教學模式的同時，提升大型儀器在實驗技術人才培養上的作用。以探究“H2O2誘導RAW264.7細胞系細胞凋亡”為出發點，學生利用研究級倒置熒光顯微鏡觀察細胞核Hoechst 33258染色情況，利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，并自行查閱文獻分析實驗結果，完成開放性實驗教學。通過這種模式，提高醫學實驗技術專業學生對細胞凋亡知識和大型儀器實踐操作的掌握水平，為學生未來勝任實驗技術工作打下良好基礎。

關鍵詞 醫學實驗技術專業；大型儀器；開放性實驗；實驗教學；流式細胞儀；熒光顯微鏡；細胞凋亡

中圖分類號：G642.423 文獻標識碼：B

文章編號：1671-489X（2024）17-0-04

0 引言

提升醫學本科生的科技創新能力，培養具有創新思維和適應社會發展需求的人才，是醫學高等院校面臨的重要挑戰[1]。醫學實驗技術專業主要培養具備基礎醫學、臨床醫學、醫學實驗技術等基本理論知識、基本技能，具有創新能力，能在各級醫院、血站、疾病控制中心、醫學院校和科研院所等部門的實驗室從事醫學實驗和醫學研究的應用型人

才[2-3]。該專業本科生的培養方案注重學生發揮主觀能動性，強調通過組織多樣化教學資源引導學生獲得學習經驗，促進高素質應用型醫學實驗技術人才培養[4]。隨著醫學實驗技術的發展，借助科研平臺大型儀器進行實驗教學成為一種趨勢[5]。

我國各個高校都擁有大型儀器共享平臺，除了向科研人員提供分析測試服務外，還為本科生提供參觀教學服務[6]。大型儀器在本科教學中的應用和實踐有望成為增強創新人才培養的重要手段，能夠提高學生在科研中運用實驗技術理論知識解決實際問題的能力[7]。本研究在醫學實驗技術專業實驗教學過程中融入大型儀器的使用，以學生能夠掌握檢測細胞凋亡技術手段為目標，整合細胞培養平臺、熒光顯微鏡和流式細胞儀等大型儀器資源，引導學生完成開放性實驗。本模式可以促進學生對實驗知識和實驗經驗的儲備，為醫學實驗技術專業實驗教學模式改革提供依據。

1 教學設計

1.1 實驗課題

氧化應激是指細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累過多，引起細胞氧化損傷的過程。細胞呼吸作用、化學反應、細胞吞噬作用等內源性因素以及溫度變化、環境毒素污染、疾病狀態等外源性因素引起的ROS水平升高，會導致細胞和組織的生理與病理反應。由于ROS可以直接或間接氧化DNA、蛋白質和脂質等生物大分子，可誘發基因的突變、蛋白質變性和脂質過氧化，進而引起機體動脈粥樣硬化、神經退行性病變、心腦血管疾病、炎癥、代謝紊亂和腫瘤等疾病。因此，氧化應激與各種疾病的發生發展密切相關，也與體內細胞老化和細胞凋亡存在十分密切的關系[8-9]。

在ROS中，H2O2是最普遍的細胞氧化劑，在生物活性的氧化還原調節中起主要作用。H2O2在細胞內保持在1～100 nM的低濃度范圍內。內源和外源因素刺激會觸發H2O2的濃度增加，引起細胞增殖、分化、遷移和凋亡等過程的改變。巨噬細胞在宿主防御系統中起重要作用，極易受氧化損傷，一些外源毒性物質可刺激巨噬細胞產生過量ROS，ROS轉化為H2O2觸發細胞凋亡[10]。細胞凋亡是在基因控制下的細胞程序性死亡，凋亡細胞會發生典型的形態學變化，包括細胞皺縮、細胞膜囊泡、核固縮、DNA片段化等。H2O2可以誘導細胞內源性氧化應激，導致細胞結構與功能異常甚至細胞凋亡[11]。因此，巨噬細胞是研究氧化損傷的合適模型。

本研究以長治醫學院2020級的38名醫學實驗技術專業本科學生為實驗組，在實驗教學過程中，教師以“H2O2誘導RAW264.7細胞系細胞凋亡”為開放性實驗內容，讓學生查閱文獻并撰寫詳細實驗方案。

1.2 理論教學

課堂教授細胞凋亡檢測原理、方法；講授倒置熒光顯微鏡的儀器結構、熒光成像原理、樣品制備和成像基本操作流程；講授流式細胞儀的液流系統、光學系統、信號采集系統和數據分析系統的構造與原理，樣品制備和檢測基本操作流程。

1.3 大型儀器培訓及使用

教師提出實驗課題，明確細胞凋亡檢測的實驗目的、大型儀器原理和預期結果，學生自主查閱資料，加強對實驗過程的理解。實驗教學過程中，教師現場演示開機流程及注意事項、儀器運行軟件的使用、研究級倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀信號采集與分析方法、儀器關機流程、儀器日常維護等事項。學生現場觀摩后，各組輪換自主測試樣品。培訓過程中，隨機提問學生闡釋熒光顯微鏡和流式細胞儀的構造、待測標本制備情況、儀器的檢測原理、實驗注意事項等，了解學生掌握情況。教師全程跟進實驗，檢測過程中詳細演示大型儀器操作，引導學生完成實驗內容和實驗指標檢測。學生完成實驗后對實驗結果進行討論，撰寫實驗報告，并對教學效果進行評價。

1.4 教學效果評估

實驗教學結束后，教師按課堂表現占10%、實驗操作規范性占30%、實驗結果占30%、實驗報告規范與豐富程度占30%的比例給出學生成績。調查這種方式的實驗教學效果，為后續更好地開展這種開放性實驗教學提供參考。調查表以選項形式設計問卷，以2020級38名參與本次實驗的學生為實驗組，以2019級沒有參與該項實驗的37名學生為對照組。對細胞凋亡和大型儀器知識與實驗經驗的掌握情況進行不記名調查，問卷收回后采用GraphPad軟件對內容進行統計分析。計數資料以n表示，進行χ2檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗教學方案

2.1 實驗材料

細胞：用于流式細胞檢測和Hoechst染色的細胞設對照組、100 μM H2O2處理組和200 μM H2O2處理組。

材料與試劑： RAW264.7細胞系、DMEM培養基、胎牛血清、H2O2溶液、Hoechst染色液、4%多聚甲醛、甘油封片劑、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、PBS緩沖液、載玻片、無菌蓋玻片、六孔細胞培養板。

儀器：研究級倒置熒光顯微鏡（Leica DMi8）、流式細胞儀（BD FACS Cantoll）。

2.2 實驗方法

采取小組教學模式，將學生分為六組，每組6～7人進行合作實驗。

2.2.1 細胞培養

RAW264.7細胞系由長治醫學院中心實驗室凍存，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2.2 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡

熒光顯微鏡可以對活細胞或固定細胞進行熒光檢測，是細胞形態學、細胞生物學、分子生物學等多個領域強有力的科研工具。Hoechst 33258是一種用于細胞凋亡檢測的熒光染料，最大激發波長是350 nm，最大發射波長是460 nm[12]。細胞凋亡時，染色質DNA出現缺口甚至斷裂，致使染色質出現凝聚和邊緣化現象。在熒光顯微鏡下觀察，Hoechst著色的活細胞核呈均勻彌散藍色熒光，而凋亡的細胞核內可見碎塊狀致密濃染區，顏色略發白。

每組學生須完成實驗流程：以3×105每孔細胞數接種六孔細胞培養板中，細胞貼壁后，實驗組分別加入終濃度為100 μM和200 μM的H2O2培養24 h。4%多聚甲醛固，PBS漂洗，加入Hoechst 33258染色；PBS漂洗后甘油封片；熒光顯微鏡下觀察，實驗組和控制組各拍五個視野，記錄每個視野下出現致密強熒光的凋亡細胞數，計算凋亡率。圖1所示為學生結果的代表圖，對照組細胞核著色均勻，而H2O2處理組觀察到了一定比例的細胞出現細胞核致密濃染區域，表明H2O2引起了巨噬細胞凋亡現象。

2.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

流式細胞術是應用流式細胞儀液壓系統將經熒光染色的單細胞懸液壓入流動室，快速流動的鞘液包裹單列細胞，經過檢測區時，在激光器發出的激光束照射下，細胞產生熒光。熒光信號的強弱反映所測細胞表面或細胞內分子的數量[13]。Annexin V是檢測早期細胞凋亡最靈敏的指標之一，Annexin V蛋白可以與磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine， PS）結合。PS正常分布在細胞膜內側。在細胞凋亡早期，PS外翻到細胞膜外，可用帶FITC綠色熒光標記的Annexin V結合并標記。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一種DNA染色試劑，在嵌入DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細胞膜，但可以穿透凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞。FITC的激發波主峰在490 nm，發射光主峰在520 nm；PI的激發波主峰在535 nm，發射光主峰在620 nm。Annexin V與PI聯合使用，可通過流式細胞儀檢測凋亡特征?；罴毎蔄nnexin V-/PI-，早期凋亡細胞呈Annexin V+/PI-，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結合染色呈Annexin V+/PI+雙陽性[14]。

每組學生須完成實驗流程：用胰蛋白酶消化d對照組和H2O2處理組細胞后，收集于離心管中；將細胞制成約2×106cells/mL單細胞懸液，加入Binding Buffer懸浮細胞；向細胞懸液中加入Annexin V-FITC混勻后，再加入PI染液混勻；室溫避光反應5～15min上機檢測。

按操作規程，教師邊操作邊講解，依次調節各通道參數并設置好熒光補償，每次用流式細胞儀獲取10 000個細胞，講解實驗結果分析過程，學生自行分析結果。圖2所示為學生結果的代表圖，圖中第二象限Q2代表中晚期凋亡細胞，第三象限Q3代表早期凋亡細胞，兩者之和表示凋亡細胞的比例。結果表明，H2O2處理增加了巨噬細胞凋亡的比例。

3 實驗教學效果

本教學模式以學生為中心，以學生有效合作承擔開放性實驗為目的，重點從大型儀器操作實踐方面改進醫學實驗技術專業的實驗教學模式。針對本次實驗利用大型儀器在醫學實驗技術專業實驗教學中的應用效果如何進行問卷調查，調查內容及評價結果見表1。如表1所示100%的學生認為有助于對實驗技術的理解和運用并有助于科研思維的培養，94.7%的學生認為應繼續實施。

通過學生對細胞凋亡知識和細胞培養、熒光顯微鏡應用以及流式細胞儀應用的掌握情況的調查發現（表2），實驗組和對照組對細胞培養技術的掌握情況無顯著差異（P＞0.05），是因為學生在細胞生物學實驗課程中學習過相關技術或者在課余時間通過參與科研項目實踐操作過這一技術；本次實驗，顯著增強了學生對細胞凋亡和大型儀器知識與實驗經驗的掌握（P＜0.05），具體如表2所示。

教師設定檢測細胞凋亡的實驗目標，學生自發地查閱文獻，完成操作步驟，通過大型儀器檢測分析H2O2是否可以誘導細胞凋亡，并通過查閱細胞氧化應激相關文獻，延伸分析此實驗有何臨床意義。通過對學生的調查可知，整個培養過程有利于學生比較系統地掌握熒光顯微鏡和流式細胞儀理論知識與專業技術，提升通過實驗技術分析和解決科研問題的能力。

4 結束語

基于高校大型儀器平臺的機遇和面臨的挑戰，依托學校大型儀器服務平臺開設開放性實驗課程，使大型儀器在醫學實驗技術專業教學和人才培養上發揮出更大的作用和潛能。以高級熒光顯微鏡和流式細胞術為例，在本科生課程中設計檢測細胞凋亡實驗的教學內容，通過該實驗模式，學生全面參與實驗設計、文獻參閱、樣品準備、上機檢測、數據采集、數據分析等，不僅學習了熒光顯微鏡和流式細胞儀的儀器構造、檢測原理、參數調節和數據采集，還深入理解了細胞周凋亡的概念，掌握了兩種細胞凋亡的檢測方法。

在實驗教學過程中引入大型儀器，構建“實驗項目—自主學習—自主實驗—應用實踐教學—效果評估”的教學模式，增強了實驗教學的開放性與自主性，能夠提高醫學實驗技術專業學生的實踐能力。大型儀器在本科教學中的應用是增強創新人才培養的重要手段。本實驗教學模式實現了教學與科研的相互結合，既提高了熒光顯微鏡和流式細胞儀等大型儀器的利用率，又推進了醫學實驗技術專業學生創新能力的培養工作。整合大型儀器資源對醫學實驗技術專業本科生創新能力的培養成效較明顯，下一步仍需不斷總結實驗過程中的問題，以創新能力培養為出發點繼續探索和改進，形成成熟可推廣的模式和方法。

5 參考文獻

[1] 林桂淼，劉曉宇，陳心春，等.醫學本科生科技創新能力培養體系建設及效果分析[J].基礎醫學教育，2021，23（2）：92-94.

[2] 耿世龍，紀書婷，陳英利，等.創業實踐引領醫學實驗技術學生創新能力培養的研究與實踐[J].中華醫學教育探索雜志，2021，20（1）：36-38.

[3] 張敬華，席小平，韓蓓，等.高等醫學專業實驗技術隊伍的現狀與發展思路[J].醫學教育研究與實踐，2020，28（5）：758-760，839.

[4] 趙頌，朱弘焱，田鶴.醫學高校開放性實驗平臺的運行與管理[J].中國繼續醫學教育，2021，13（7）：110-113.

[5] 張微，余常，楊亦奇，等.醫學類高校教學實驗室開放管理模式研究[J].成都中醫藥大學學報（教育科學版），2021，23（03）：83-84，118.

[6] 牛熙，李升，齊芬芳.流式細胞儀在本科生“分子生物學”課程實驗教學中的應用與實踐[J].教育教學論壇，2020（45）：379-381.

[7] 呂培然，裴建，高正，等.氧化應激與糖尿病周圍神經病變的機制研究進展[J].中國醫學創新，2022，19（2）：185-188.

[8] 馬琳，張曉萍.艾司洛爾聯合卡維地洛對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者心功能、炎癥反應、免疫及氧化應激的影響[J].感染、炎癥、修復，2021，22（2）：94-98.

[9] 黃影，朱麗華.巨噬細胞在動脈粥樣硬化中作用的研究進展[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25（5）：1-4.

[10] Simion V， ZHOU HaoYang， Haemmig S， et al.A macrophage-specific lncRNA regulates apoptosisand atherosclerosis by tethering HuR inthe nucleus[J].Nature Communications，2020，11（1）：6135.

[11] 姜麗艷，閆國棟，孟繁清，等.細胞影像分析大型儀器應用于本科實驗教學的探索[J].生命的化學，2019，39（1）：190-194.

[12] 陳松峰，寇紅偉，尚國偉，等. Necrostatin-1對壓力誘導的髓核細胞自噬及凋亡的影響[J].中華實驗外科雜志，2021，38（5）：878-881.

[13] 陳希辰，夏崢嶸.流式細胞共享平臺實驗教學改革[J].基礎醫學教育，2018，20（12）：1094-1096.

[14] 董興艷.流式細胞技術的臨床應用與分析[J].中國實用醫藥，2012，7（36）：45-46.

*項目來源：山西省高等學校一般性教學改革創新立項項目“基于OBE理念的醫學實驗技術專業本科生人才培養體系建設與探索”（基金編號：J20231065）；山西省教育科學“十四五”規劃課題“新醫科背景下，基于虛擬教研室的基礎醫學課程體系建設”（基金編號：GH-220285）。

作者簡介：任晨霞，高級實驗師；程紅兵，副教授；冀菁荃，通信作者，長治醫學院中心實驗室主任，副教授。