漢中地區某豬場仔豬腹瀉性大腸埃希氏菌的分離鑒定及耐藥性檢測

摘 要：為明確漢中某豬場仔豬腹瀉的病原菌及其耐藥情況，試驗無菌采集腹瀉仔豬病料，分離培養后經生化試驗、16S rRNA PCR鑒定、藥物敏感性試驗以及小鼠致病性試驗等研究進行探索。試驗結果顯示該分離株在各培養基上的菌落特征、革蘭氏染色鏡檢結果及生化特性與大腸埃希氏菌相吻合分離菌株16S rRNA序列與GenBank中登錄的大腸埃希氏菌同源性達99%以上分離菌株對氨芐西林、多黏菌素B、氯霉素、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢唑林等耐受，對頭孢他啶、米諾環素、阿米卡星3種藥物敏感，同時對多種抗生素產生耐藥性在小鼠致病性試驗中發現48 h內試驗組小鼠全部死亡且對照組無死亡，并從死亡小鼠組織中得到該菌株，說明分離菌有較強的致病力。結果表明，本試驗所分離的病原菌為多重耐藥致病性大腸埃希氏菌。本研究結果可為該豬場仔豬腹瀉性大腸埃希氏菌病的臨床防治提供科學依據。

關鍵詞：仔豬大腸埃希氏菌分離鑒定耐藥性

中圖分類號：S852.61" 文獻標識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）08-0095-05

Isolation， Identification and Drug Resistance Detection of %Escherichia coli %in Piglets in Hanzhong

WANG Yulong+1，JANG Ye+1，LI Ying+2，WANG Feng+1，JIANG Guiling+1，JIA Yong+1，LI Chao+3，L Ni+2，MA Yonghua+1

（1.Hanzhong Vocational and Technical College， Hanzhong， Shaanxi 723000，China 2. Northwest Aamp;F University，" Yangling，Shaanxi

712100，China3. Animal Disease Prevention and" Control Center of Yaozhou District， Tongchuan， Shaanxi 727100，China）

Abstract：To clarify the pathogenic bacteria and drug resistance of diarrhea in piglets at a farm in Hanzhong， piglets were collected using sterile techniques. They were isolated and cultured using biochemical tests， 16S rRNA PCR identification， drug sensitivity tests， and mouse pathogenicity tests. The results showed that the colony characteristics， Gram stain microscopic results， and biochemical characteristics of the isolate coincided with %E. coli %the sequence of the isolate's 16S rRNA was 99% identical to E. coli strains registered in GenBank. The isolate was sensitive to ceftazidime， minocycline， and amikacin， but resistant to ampicillin， polymyxin B， chloramphenicol， ceftriaxone， cefothiophene， and cefazolin. All mice in the experimental group died， whereas the control group survived the strain was isolated from the tissues of the deceased mice， indicating high pathogenicity. The pathogens isolated in this experiment were identified as multidrug-resistant pathogenic %E. coli. %This study provides a scientific basis for the clinical prevention and treatment of %Escherichia coli %in piglets.

Key words：Piglets %Escherichia coli %Separation identificationDrug resistance

目前，仔豬腹瀉性大腸埃希氏菌病依然是危害養豬業主要的疾病之一，嚴重影響仔豬成活率[1]。不同地區大腸埃希氏菌的血清型分布差異大，制備有效疫苗防控難度增加，濫用抗菌藥物造成耐藥菌株增多等多種因素，導致臨床防治大腸埃希氏菌病困難加劇，給養殖業造成了極大的經濟損失[2，3]。

2023年漢中地區某規模化養殖場陸續出現仔豬腹瀉而死情況，研究團隊無菌采集病料，進行病原菌分離鑒定并檢測其耐藥性，擬為該豬場仔豬腹瀉性大腸埃希氏菌的臨床防治提供科學依據。

1 材料

1.1 病料

本試驗的病料來源于陜西漢中某規模化豬場的一死亡仔豬。

1.2 主要試劑

細菌微量生化反應管（杭州濱和生物公司）細菌藥敏試（杭州濱和生物公司）DNA提取試劑盒（北京天根生物公司）引物合成（西安擎科生物公司）。

1.3 主要儀器

電泳儀（北京六一儀器廠）凝膠成像儀（Kodak公司）培養箱（上海滬南科學儀器廠）PCR儀（Eppendorf公司）。

1.4 實驗動物

體重（25±2）g昆明系小鼠10只，購自四川達碩生物科技公司。

2 方法

2.1 細菌分離鑒定

無菌采集死亡小豬的肝臟、小腸等病料，分別在麥康凱瓊脂培養基及伊紅美藍瓊脂培養基上進行劃線接種[4，5]，恒溫箱37 ℃培養24 h后，觀察菌落形態、顏色等特征進行初步篩選，挑取單一菌落純化培養，然后進行革蘭氏染色鏡檢。

2.2 生化試驗

參照細菌生化微量鑒定管使用說明，無菌挑選單個菌落接種于生化微量鑒定管，37 ℃恒溫培養16 h，觀察反應并記錄結果。

2.3 細菌16S rRNA PCR鑒定

設計16S rRNA的通用引物[6]，序列詳見表1，引物由西安擎科生物技術有限公司合成。對擴增PCR產物進行測序，登錄GenBank將測序結果與參考菌株比對，分析其同源性并進行判定。

2.4 小鼠致病性試驗

將小鼠分為試驗組與對照組，每組5只。用無菌生理鹽水將分離菌配制成濃度1×10+8 CFU /mL，試驗組小鼠按照0. 25 mL/只腹腔注射[7]，對照組小鼠按照相同劑量腹腔注射無菌生理鹽水，按照12 h、24 h、36 h、48 h、60 h及72 h不同時間段觀察并記錄各組小鼠的臨床情況，及時無菌采集死亡小鼠肝臟等組織并分離鑒定其體內病原菌。

2.5 藥物敏感性試驗

采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗[8]，按照CLSI的標準進行結果判斷，并分析分離菌株的耐藥性。

3 結果

3.1 細菌分離鑒定結果

病樣接種于鑒別培養基，挑取單個菌落純化培養后，在各類型培養基上劃線觀察菌落形態。圖1可見紅色、透明菌落生長在麥康凱瓊脂培養基圖2可見帶有金屬光澤的菌落生長在伊紅-亞甲藍瓊脂培養基圖3可見兩端鈍圓的G-桿菌。分離菌在各培養基上的菌落特征、革蘭氏染色特性及鏡檢結果與大腸埃希氏菌相吻合。

3.2 生化試驗結果

生化試驗結果詳見表2。1～4號細菌微量生化反應管可被分離菌分解，并能夠產酸產氣5～8號細菌微量生化反應管反應呈陰性9～10號細菌微量生化反應管反應呈陽性。分離菌株生化試驗結果與標準大腸埃希氏菌的生化特性相符合。將分離菌株命名為HZYCY1。

3.3 細菌16S rRNA PCR鑒定結果

將分離菌株進行PCR鑒定，PCR擴增結果見圖4，經瓊脂糖凝膠電泳可見1 429 bp大小片段，與預期相符。測序結果登錄GenBank與參考株比對（圖5），同源性達99 %以上。結果表明分離菌株（HZYCY1）為大腸埃希氏菌。

3.4 小鼠致病性試驗結果

小鼠經細菌感染試驗后發現，試驗組小鼠在感染12 h無異常，24 h后可見小鼠精神沉郁、采食量下降、腹瀉等癥狀，36 h后有兩只小鼠死亡，之后剩余實驗組小鼠在48 h內陸續全部死亡。小鼠死亡后無菌解剖其尸體，將肝臟組織接種到伊紅美藍培養基，分離培養鑒定得到與感染菌一致菌株。對照組健康存活。

3.5 藥物敏感性試驗結果

對分離菌株進行24種抗生素測試，由表3可知，藥敏試驗結果顯示，該分離菌對頭孢他啶、米諾環素、阿米卡星3種藥物敏感，對頭孢噻肟、慶大霉素、氨曲南3種藥物中度敏感，對氨芐西林、卡那霉素、多黏菌素B、氯霉素、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢唑林、頭孢哌酮、哌拉西林、諾氟沙星、鏈霉素、妥布霉素、環丙沙星、氧氟沙星、左氟沙星、呋喃妥因、四環素、萬古霉素18種藥物耐藥。

4 討論

大腸埃希氏菌耐藥現象在國內外都很嚴重，耐藥的種類、耐藥范圍、多重耐藥等均呈逐年上升趨勢，導致超級藥性菌株頻頻出現，嚴重危害養殖業健康發展[9～11]。本試驗無菌采集漢中地區某規模化豬場腹瀉仔豬病料，分離培養后經生化試驗、16S rRNA PCR鑒定獲得大腸桿菌菌株（HZYCY1）小鼠細菌感染試驗結果顯示實驗組的小鼠死亡并從肝臟中分離到相同的病原菌，說明分離菌株具有較強的致病性該分離菌株對氨芐西林、多黏菌素 B、氯霉素、頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢唑林等耐受，研究表明該分離菌株（HZYCY1）為多重耐藥性大腸埃希氏菌，對頭孢他啶、米諾環素、阿米卡星3種藥物敏感。本研究可為該豬場仔豬腹瀉性大腸埃希氏菌的臨床防治提供科學依據。

耐藥細菌的頻繁出現對人類、家畜以及環境的健康產生巨大威脅[12]。據報道，全球“禁抗，減抗”始于歐盟，而后擴大到全球大部分地區[13，14]。我國養豬業的發展從養殖規模到肉品消費量在逐年上升，消費者的觀念從吃飽轉向吃好，對于食品安全問題的關注度提高，抗生素濫用導致的細菌耐藥、藥物殘留等公共安全問題日益突出，嚴重危害消費者的食品健康，也不利于養殖業健康發展[15～17]。農業農村部于2017、2021年相繼發布《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017—2020年）》、《全國獸用抗菌藥使用減量化行動方案（2021—2025年）》，2023年更進一步為落實“飼料停抗、養殖減抗”的要求，推進獸用抗菌藥使用減量、擴充高效安全飼料原料和飼料添加劑品種[18～20]。各項“禁抗、減抗”政策出臺將逐步規范我國養殖行業濫用抗生素這一現狀，目前常見抗生素替代品如微生態制劑、中草藥制劑、酶制劑、抗菌肽等有較好發展前景[21，22]，可有效推動畜牧業的健康綠色發展。

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基金項目：陜西省教育廳一般專項科研計劃項目（21JK0494）。

第一作者簡介：王玉龍（1988-），男，碩士研究生，主要從事動物疫病防治研究。

通信作者：馬永華。