摘 要：用PLS-A固相萃取小柱處理魚肉樣品，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)魚肉中的32種獸藥殘留進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了樣品提取方法、色譜條件，并研究了方法的線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度以及基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，32種獸藥的回收率在75.3%～114.7%，檢出限為1.0 μg·kg-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%（n=6），32種獸殘?jiān)?～100 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均高于0.991。該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，可為魚肉中32種獸藥殘留的檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）；獸藥殘留；PLS-A；魚肉

Simultaneous Determination of 32 Veterinary Drugs in Fish by High performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Yanlong， HUANG Leipeng， HAN Xuegong， WANG Zhaoquan

（Changyi Center for Inspection and Testing， Changyi 261300， China）

Abstract： In this experiment， a PLS-A solid-phase extraction column was used to treat fish meat samples， and high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to determine the residues of 32 veterinary drugs in fish meat. The experiment optimized the sample extraction method and chromatographic conditions， and studied the linear range， accuracy， precision， and matrix effects of the method. The results showed that the recovery rates of 32 veterinary drugs ranged from 75.3% to 114.7%， with a detection limit of 1.0 μ g·kg-1 and a relative standard deviation of less than 15% （n=6）， there was a good linear relationship between the 32 animal residues in the range of 1～100 ng·mL-1， with correlation coefficients higher than 0.991. This method has high accuracy and good precision， and can provide technical support for the detection of 32 veterinary drug residues in fish meat.

Keywords： high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS）; veterinary drug residues; PLS-A; fish

我國在畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域使用較多的獸藥主要有磺胺類、五氯酚酸鈉、孔雀石綠類、β受體激動(dòng)劑類、四環(huán)素類、氯霉素類和喹諾酮類等化合物[1]。而藥物濫用是造成畜牧產(chǎn)品污染的主要原因之一。藥物殘留通過代謝途徑進(jìn)入動(dòng)物肌肉等組織中，最終通過食品鏈進(jìn)入人體，這不僅會(huì)引發(fā)過敏反應(yīng)，還可能增加人體對(duì)藥物產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)。目前，獸藥殘留的檢測(cè)方法通常基于獸藥種類進(jìn)行分類，這造成了檢測(cè)方法的多樣性和前處理方法的不統(tǒng)一[2]。大多數(shù)檢測(cè)方法的前處理過程煩瑣，且回收率較低，此外，開發(fā)能同時(shí)檢測(cè)多種獸藥殘留的液相色譜-質(zhì)譜法面臨一定的挑戰(zhàn)[3]。鑒于實(shí)驗(yàn)室人員有限、樣品種類多、檢測(cè)項(xiàng)目復(fù)雜以及檢測(cè)工作量大等現(xiàn)狀，在本方法中，樣品處理采用迪馬科技PLS-A固相萃取小柱，無須進(jìn)行活化和平衡步驟，且提取液直接通過小柱，能夠有效去除蛋白、鹽、磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物。該方法簡便、快速，能同時(shí)檢測(cè)國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則中規(guī)定的32種獸藥殘留，其不僅縮短了檢測(cè)周期，還在降低檢測(cè)成本的同時(shí)大幅提升了檢測(cè)效率[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）；甲酸（色譜純）；屈臣氏專業(yè)蒸餾水；90%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）；10%乙腈水溶液；32種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為100 μg·mL-1）。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Ultra液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；GTCS-2013B垂直振蕩器；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器；TGL-20M低溫離心機(jī)；EA32型多功能樣品濃縮儀。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100 μg·mL-1）。混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液（1.0 μg·mL-1）：取各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液50 μL于5 mL容量瓶，用乙腈定容至5 mL。混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液（0.1 μg·mL-1）：取500 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液于5 mL容量瓶，用乙腈定容至5 mL。

1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取0.1 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL和30 μL，以及1.0 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL、20 μL、50 μL和100 μL，分別加入6份經(jīng)提取和凈化的樣品空白中，50 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑?0%乙腈水溶解殘余物并定容至1 mL，配制成濃度為1 ng·mL-1、3 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1的基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.5 樣品處理

取2.50 g（精確到0.01 g）樣品，加入10 mL 90%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）提取，振蕩5 min，超聲5 min，5 000 r·min-1離心5 min，取出上清液加入PLS-A柱中，接收4 mL流出液；將流出液在50 ℃水浴條件下氮吹至0.5 mL左右，用10%乙腈水溶液定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜后，待測(cè)。

1.6 儀器條件

1.6.1 正離子模式

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：A相為乙腈，C相為添加0.1%甲酸的水溶液；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫見表1。

（2）質(zhì)譜條件。離子模式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓：3 500 V；霧化器壓力：40 arb；輔助氣壓力：10 arb；氣簾氣壓力：0 arb；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃。

1.6.2 負(fù)離子模式

（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：A相乙腈，C相水；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫見表1。

（2）質(zhì)譜條件。離子模式：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓：-2 800 V；霧化器壓力：40 arb；輔助氣壓力：10 arb；氣簾氣壓力：0 arb；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃。32種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)表見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的選擇

分別采用乙腈、乙酸乙酯和90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液進(jìn)行樣品提取。由表3可知，與乙酸乙酯相比，乙腈的提取效率較高、成本更低，且用含水的乙腈提取液可明顯提升喹諾酮類、四環(huán)素類獸藥的提取效率；當(dāng)使用90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液作為提取溶劑時(shí)，32種獸藥及其代謝物的回收率均可維持在75.3%～114.7%。因此，選擇90%乙腈水（含0.1%甲酸）溶液作為本實(shí)驗(yàn)提取液。

2.2 流動(dòng)相的確定

本實(shí)驗(yàn)在正離子模式下選擇乙腈∶水、甲醇∶水和乙腈∶0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。有機(jī)相為乙腈時(shí)，各物質(zhì)均能實(shí)現(xiàn)較好分離且柱壓較低；水相為0.1%甲酸水時(shí)，可改善各物質(zhì)峰型提高響應(yīng)值。因此，選擇乙腈∶0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

2.3 方法檢出定量限、回收率、精密度

在優(yōu)化條件下，將1.4的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，以特征離子峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以3倍信噪比和10倍信噪比時(shí)的質(zhì)量濃度來定義方法檢出限和方法定量限。由表4可知，32種獸藥化合物在1～100 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均在0.991以上；

32種獸藥化合物的方法檢出限為1.0 μg·kg-1，定量限為3 μg·kg-1，符合獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)（加標(biāo)水平為1 μg·kg-1、20 μg·kg-1、100 μg·kg-1）回收實(shí)驗(yàn)。由表4可知，回收率（采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液定容）為75.3%～114.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.4%～11.9%。結(jié)果表明此方法精密度和準(zhǔn)確度均符合獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中，基質(zhì)效應(yīng)是決定檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確的影響因素之一，較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果可產(chǎn)生較大的影響[5]。基質(zhì)效應(yīng)為基質(zhì)標(biāo)與溶劑標(biāo)的比值，由表5可知，諾氟沙星、培氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素和土霉素5種化合物存在離子增強(qiáng)作用，其他27種化合物均存在離子抑制作用。

3 結(jié)論

本研究開發(fā)的方法通過合并和簡化前處理步驟，避免了對(duì)固相萃取柱的活化過程，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種獸藥殘留的同時(shí)檢測(cè)。這種方法不僅縮短了前處理時(shí)間，還降低了檢測(cè)成本。它能夠在確保準(zhǔn)確性的同時(shí)提高檢測(cè)速度，簡化操作過程。此外，該方法還滿足了同時(shí)處理多批次、多獸殘樣品的需求，符合現(xiàn)代食品安全檢測(cè)的高效率和高準(zhǔn)確性要求。

參考文獻(xiàn)

[1]劉培勇，張惠，米之金，等.兩步液液萃取-固相萃取凈化結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中11種磺胺類獸藥殘留[J].色譜，2019，37（10）：1098-1104.

[2]王一涵，王展華，陳萬勤，等.固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定豬肉中14種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2019，38（10）：1247-1253.

[3]李華，楊娟，陳黎.超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中8種喹諾酮類獸藥殘留的不確定度評(píng)定[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（8）：3237-3243.

[4]方從容，高潔，王雨昕，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中125種獸藥殘留[J].色譜，2018，36（11）：1119-1131.

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