灌木辣椒（Capsicum frutescens）抗象耳豆根結線蟲的組織學及生理生化特征分析

關鍵詞：象耳豆根結線蟲；抗性；灌木辣椒；組織學；POD；PAL

中圖分類號：S436.418 文獻標志碼：A

辣椒（Capsicum spp.）原產于中南美洲熱帶及亞熱帶地區，被人類食用的歷史長達9500 多年，是世界上使用最廣泛的香料和調味品之一[1-2]。目前，生產上常用的辣椒栽培種有一年生辣椒（C.annuum）、灌木辣椒（C. frutescens）、中國辣椒（C.chinense）、下垂辣椒（C. pendulum）和茸毛辣椒（C. pubescen）等。隨著辣椒產業的不斷擴大，有限的土地資源和市場需求表現出不平衡狀態，大多數地區出現連作和濫用農藥的現象，致使辣椒病蟲害反復發生。其中，根結線蟲被認為是辣椒生產中的主要制約因素之一[3-4]。

根結線蟲（Meloidogyne spp.）為無色透明的無脊椎動物[5]，生產上的常見種包括南方根結線蟲（M. incognita）、爪哇根結線蟲（M. javanica）、花生根結線蟲（M. arenaria）、北方根結線蟲（M.hapla）和象耳豆根結線蟲（M. enterolobii）[6]。其中，象耳豆根結線蟲是近幾年較受關注的一種根結線蟲，廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶地區[7-12]。海南地區氣候炎熱，適合象耳豆根結線蟲的發生和傳播。黃偉明等[13]對海南島葫蘆科蔬菜上的根結線蟲種群進行鑒定，發現象耳豆根結線蟲發生率高達80%。李周容等[14]對海南18個市縣種植的蔬菜進行根結線蟲病原物分子鑒定，發現象耳豆根結線蟲的檢出率最高，為南方根結線蟲檢出率的3 倍。LONG 等[4]發現海南辣椒生產中的優勢根結線蟲種群為象耳豆根結線蟲。象耳豆根結線蟲侵染性極強，已克服了辣椒的N、Me1、Me3和Me7 等根結線蟲抗性基因[15-16]，急需挖掘新的抗性資源，并深入解析其抗性機理，為這些抗性種質資源的創新性利用提供依據。

根結線蟲的二齡幼蟲（J2）一般使用探針以機械和酶促的方式破壞植物細胞壁從而侵入根系細胞，3～5 d 即可建立取食點[17]。取食點一般由5～8個巨細胞組成，是根結線蟲的營養物質來源[18]。隨著根系細胞有絲分裂的進行，巨細胞中的細胞質愈加致密，卻無法正常分裂，此時的巨細胞比正常細胞含有更多的蛋白質、氨基酸和核酸等物質[19]。研究表明，巨細胞的崩潰可能會對根結線蟲導致的危害起到抑制作用[20]。由此可見，巨細胞對根結線蟲的寄生生活尤為重要，其形態結構和內容物的變化均可能影響根結線蟲在根系中的生長發育。為此，在對抗性資源進行機理研究的過程中，有必要研究根系內J2 幼蟲的發育狀態及巨細胞的變化情況，從解剖學角度探索抗性產生的原因，為后續深入研究抗性機理提供線索。

植物自身的生理抗性主要體現在植物體內防御酶的變化。病原菌侵染植物后，活性氧（ROS）在體內發生較大的變化，ROS 過量積累會對植物造成氧化損傷，因此需要立即激活抗氧化防御機制[21-22]。過氧化物酶（POD）是植物體內主要的活性氧清除酶之一，可清除ROS，減少膜質過氧化，并通過延緩DNA 損傷來預防蛋白質損傷，從而起到保護宿主的作用[23-24]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷代謝中重要的限速酶，能夠推動苯丙烷代謝的第一步反應，而苯丙烷代謝途徑的重要產物之一是木質素單體，其可聚合形成木質素，使細胞壁加厚，從而提高植物對不良因素的抵抗能力[25-26]。對根結線蟲抗性資源進行防御酶活性的研究，有助于加深對其抗性機理的認識。

小米辣屬于半野生灌木辣椒資源，零星分布于我國云南和海南地區[27]。小米辣植株粗大，根系發達，對許多生物及非生物脅迫都具有良好的抗性[28-30]，本課題組前期從30 份海南本地收集的小米辣（C. frutescens）資源中篩選出一份抗象耳豆根結線蟲的種質CF25。為進一步解析其抗性生理機制，本研究擬對極端抗、感種質接種象耳豆根結線蟲，采用染色和石蠟切片等手段探究其解剖學變化，并通過測定POD 和PAL 的酶活性初步揭示其抗性生理學基礎，為后續深入解析灌木辣椒抗象耳豆根結線蟲機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

象耳豆根結線蟲抗性材料CF25、感病材料CF29 和感病對照CF20 均為海南本地收集的小米辣（C. frutescens）資源。

1.2 方法

1.2.1 象耳豆根結線蟲抗性鑒定課題組前期從患病辣椒根部挑取單個根結線蟲卵粒，接種到用滅菌基質培養的空心菜根部。3 個月后挑取新鮮卵粒，常溫孵化為二齡幼蟲（J2），提取DNA，并通過種屬特異性分子標記鑒定其屬于象耳豆根結線蟲[31]，隨后將純化的根結線蟲種群保存于空心菜植株根部。

將小米辣種子55 ℃水浴15 min，30 ℃水浴5 h，置于28 ℃恒溫培養箱中催芽，種子露白后播種。挑取成熟卵粒，置于裝有少量清水的培養皿孵化。收集孵出的J2，配制成1000條/mL 的J2 懸浮液。采取完全隨機區組設計，3種辣椒材料各選取6 片真葉的種苗8 株，分別接種1 mL J2懸浮液。接種后的辣椒苗實行常規的水肥管理，每2 周施1 次復合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）。

接種45 d 后進行抗病性鑒定。將辣椒根部洗凈晾干，稱重，并對根結和卵粒進行計數。參照BOITEUX 和CHARCHAR[32]的方法計算根結指數（gall index， GI）和卵粒指數（egg mass index，EI）。GI=單株根結數/單株根鮮重；EI=單株卵粒數/單株根鮮重。將根剪成1～2 cm 小段，加入1.2%次氯酸鈉，200 r/min 振蕩10 min，光學顯微鏡下對卵進行計數，依據GON?ALVES 等[33]的方法計算繁殖系數（reproduction factor， RF）。RF=單株卵數/單株初始接種量，若RF<1，則認為具有根結線蟲抗性。

1.2.2 根結線蟲發育形態觀察在接種后1、4、7、10、13、16、19、22、25、28 d，分別選取CF25 和CF29 種苗各3 株。洗凈根系，采用次氯酸鈉-酸性品紅法[34]對根系進行染色，在光學顯微鏡下觀察根系中根結線蟲的數量及發育形態。

1.2.3 根結線蟲侵染根系的解剖學變化觀察在接種0、1、4、7、10、13、16、22 d，分別選取CF25 和CF29 種苗各3 株。洗凈根系，無根結的植株取根尖部分，出現根結的植株取最大的根結，取樣后立即放入70%的福爾馬林-乙酸-乙醇（Formalin-Aceto-Alcohol， FAA）固定液中保存，并送至武漢賽維爾生物有限公司進行石蠟切片的制作和染色。

1.2.4 防御酶活性測定在接種0、5、10、15、25 d，分別選取CF25 和CF29 種苗各3 株，洗凈根系，使用北京索萊寶科技有限公司過氧化物酶活性檢測試劑盒（BC0090）和苯丙氨酸解氨酶活性檢測試劑盒（BC0210）測定POD 和PAL 的酶活性。以不接種植株作為對照。

1.3 數據處理

利用 SPSS 22.0 軟件計算試驗數據的平均值及標準誤差，并對GI、EI、RF、根結線蟲侵入量、POD 和PAL 活性分別進行單因素方差分析，利用Duncan’s 法進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 象耳豆根結線蟲抗性鑒定

從表1可以看出，CF20的GI和EI值均較大，且RF達到17.17，表明其感病性較強，也反映了試驗條件比較適合象耳豆根結線蟲的侵染和繁殖。CF25的RF 小于1，說明該種質對象耳豆根結線蟲具有抗性。而CF29的RF值為10.11，表明該種質易受象耳豆根結線蟲感染。對3 份種質的GI、EI和RF 值分別進行方差分析，發現CF29和CF20的各項指標差異均不顯著，而CF25 相關指標均與其他2 個種質有顯著差異（P<0.05）。

2.2 根結線蟲侵入量及發育形態觀察

分別對抗、感種質接種象耳豆根結線蟲，并在接種后不同天數觀察根系內線蟲數量及發育狀態（圖1、圖2）。從線蟲數量來看，CF25 中的蟲數在接種后各時間點均少于CF29。其中，在接種第4、16 和25 天，CF25 根系中的蟲數顯著低于CF29（P<0.05）（圖1）。從線蟲的發育狀態來看，接種后1～4 d，抗、感種質中的線蟲均處于J2 時期（圖1、圖2）。第7 天，部分早期侵入的J2 逐步發育為三齡幼蟲（J3）。第10 天，CF29 根系內線蟲處于三/四齡幼蟲（J3/J4）時期，而CF25 中尚存在少量J2 幼蟲。第13 天，CF29 出現雌蟲，而CF25 無雌蟲出現。第16天，CF25開始出現雌蟲，但雌蟲體型比CF29 中的略小。第19～28天，CF25 中的雌蟲均比CF29 略?。▓D2）。以上結果說明，CF25 中的根結線蟲幼蟲發育速度比CF29 中的緩慢，且存在發育不良的現象。由此推測，CF25 對根結線蟲的抗性可能體現在2 個方面，一是阻礙J2 幼蟲的入侵，二是阻滯幼蟲在根系中的發育。

2.3 根系細胞解剖學變化

用接種后不同天數的抗、感種質根系制作石蠟切片，初步探究根系細胞的解剖學變化（圖3）。接種前，抗、感種質根系細胞皆排列正常。接種后第1 天，抗、感種質根組織中均發現J2 的侵入。第4天，根部細胞微微隆起，CF29根系變形程度大于CF25，且CF29 中的線蟲略微變粗，推測此時已經建立了取食點。第7 天，抗、感種質均形成膨大的根結，內部皮層細胞增殖聚集。第10天，每個取食點均能觀察到2～5 個巨細胞。CF25 中的巨細胞形態不規則，且細胞質較為稀疏。而CF29中的巨細胞形態比較規則，并具有均勻致密的細胞質。第13天，CF25中的巨細胞的細胞質進一步減少，而CF29中的巨細胞的細胞質依舊保持相對濃密的狀態。第16 天，CF25 中多數巨細胞的細胞質非常稀薄，根結線蟲形態異常。CF29中的巨細胞形態相對正常，細胞質依舊比較濃密，根結線蟲發育正常。第22 天，CF25 中的雌蟲萎縮，巨細胞內容物較少。而CF29 中的雌蟲發育比較正常，巨細胞內容物始終保持濃密狀態。依據以上解剖學結果，推測抗病種質CF25 的巨細胞內容物減少，出現空洞化，從而抑制了根結線蟲的發育。

2.4 POD活性變化

為進一步探究CF25 抗象耳豆根結線蟲的機制，測定了接種前后抗、感種質根系的POD 和PAL 活性。從對照來看，除第5 天外，其余時間點CF29 的POD 活性大于CF25，且第5、10 和25天差異顯著（P<0.05）（圖4）。CF25 的POD 活性在接種后逐步緩慢升高，從接種后第10 天開始，POD 活性顯著高于對照（P<0.05）。在25 d時升至最高點，為12 292.54 U/g，是不接種對照的2倍。CF29 的POD 活性在接種后第5～15 天顯著低于對照（P<0.05），而在第25 天時顯著高于對照（P<0.05），且達到最高，為10 390.40 U/g。總體來說，接種前，CF25 的POD 活性略低于CF29。而接種后，CF25 在各個時間點的POD 活性均顯著高于CF29（P<0.05）。推測CF25 通過提高POD的活性來清除體內因根結線蟲侵染產生的大量ROS，從而使植株保持較穩定的生長狀態。

2.5 PAL活性變化

如圖5所示，對照組中，除第10天外，其他時間點CF25 的PAL 活性均略高于CF29（圖5），但僅在0d存在顯著性差異（P<0.05），其他時間點差異不顯著。CF25 的PAL 活性在接種第5 天時下降，之后逐漸升高，在15 d 時升至最高值，為25.32 U/g。在第10 和15 天，接種后的CF25的PAL 活性顯著高于其不接種的對照組（P<0.05）。接種后，CF29 的PAL 活性逐步升高，在25d升至最高，為21.16 U/g。接種后，CF29 的PAL 活性除在第10天略低于對照外，其余時間點均略高于對照?？傮w而言，接種后，CF25 的PAL活性均高于CF29，其中，在第10、15天，二者差異顯著（P<0.05）。PAL 是催化苯丙烷類代謝第一步反應的關鍵酶，其活性增加可能導致生成更多的苯丙烷類次生代謝產物。

3 討論

防治根結線蟲最常用的方法是使用化學殺蟲劑，但化學藥劑的濫用不僅容易導致耐藥性的問題，產生的農藥殘留還可能會對環境和人體造成負面影響[35]。采用物理或生物的方法也可防治根結線蟲，但其受外界影響因素多，防治效果不穩定。相比之下，利用植物自身的抗性來防治根結線蟲的方法較為綠色、經濟、環保，且效果相對穩定[36-38]。目前，辣椒中開展了少量抗象耳豆根結線蟲資源的挖掘工作。SOARES 等[39]從69份辣椒品種中鑒定出1 份抗象耳豆根結線蟲的灌木辣椒資源。CARRILLO-FASIO 等[40]從90份一年生辣椒中篩選出5 份抗象耳豆根結線蟲的種質資源。GON?ALVES 等[33]對39 份辣椒進行象耳豆根結線蟲抗性鑒定，僅發現1 份中國辣椒資源具有很好的抗性。由此可見，抗象耳豆根結線蟲的辣椒資源較為緊缺。本研究前期篩選出1 份抗性灌木辣椒資源CF25，其不僅根結數目較少，且產生的卵數少于初始接種量，解析其抗性機理將有助于后續抗病育種工作的開展。

從組織學的角度來看，作物抗根結線蟲機理大致有以下幾種情況：（1）抗侵入，即將根結線蟲排除在維管束之外?？骨秩胧窃S多抗病植物抵御根結線蟲侵染的普遍策略。葉德友等[41]對抗、感黃瓜材料分別接種南方根結線蟲，發現抗病品種的線蟲侵入量比感病品種低。然而，抗病材料酸黃瓜的解剖學結構與普通黃瓜基本相似，推測其抗侵入特性并非由根的特殊結構引起，可能是通過提高木質素含量使細胞壁加厚，從而達到限制線蟲侵入的目的。由此可見，木質素作為細胞壁的重要組成部分，對線蟲能起到一定防御作用。KUMARI 等[42]對水稻根結線蟲抗性材料Vandana和感病材料Pusa1121進行次氯酸鈉-酸性品紅染色試驗發現，Vandana 的線蟲侵入量比Pusa1121少，同時也發現接種后抗性水稻Vandana 的側根比 Pusa1121 有所增加，推測側根的發生形成了結構屏障，從而預防線蟲后續入侵。本研究對接種后的抗、感辣椒根系進行次氯酸鈉-酸性品紅染色，同樣發現抗病材料CF25 的根結線蟲侵染量少于感病材料CF29。通過石蠟切片發現抗、感材料根系解剖學結構并無明顯差異，且接種后也未在側根發生方面表現出明顯不同。因此，推測CF25 較強的抗侵入能力并非由根部特殊結構引起，可能與較高的木質素含量導致其細胞壁強度較大有一定關系。（2）影響取食。劉雪嬌等[43]對黃瓜抗病材料接種南方根結線蟲，發現抗病材料初生韌皮部附近的薄壁細胞層形成巨細胞，維管束完整未受到破壞；接種6 d 后，巨細胞呈延伸狀，細胞壁出現降解，且巨細胞鄰近的個別細胞空洞化，影響線蟲取食，使其無法完成正常發育。DAS 等[44]對豇豆抗病材料CB46 和感病材料null-Rk 接種南方根結線蟲，發現CB46 線蟲周圍的巨細胞可維持14 d，隨后出現巨細胞空洞化及細胞壁變薄等惡化癥狀，最終巨細胞崩潰。由此可見，巨細胞空洞化可能是寄主的一種抗性機制，且空洞化的快慢可能會影響植物抗病性的強弱。本研究發現CF25 根系中的根結線蟲比CF29 發育慢，且從接種第10 天開始，CF25 根系中的巨細胞即出現明顯的空洞化，第22 天觀察到的雌蟲偏小，呈皺縮狀。由此推測巨細胞的空洞化可能是CF25 抗根結線蟲的一個主要機制。（3）過敏性壞死。過敏性反應（HR）是植物細胞為限制病原體的生長而表現出的一種細胞死亡形式，過敏性反應與病原體的侵染和植物的抗病性有關[45]。邱志娜等[46]對新疆野生櫻桃李接種南方根結線蟲，發現2YWWD0aE1iPksWfXhmVMSg==接種1 d 后即出現過敏性反應，并同時產生大量HO，從而抑制了巨細胞的發育，使線蟲發育受阻。本研究中未發現過敏性反應現象，推測HR可能不是CF25 主要的根結線蟲抗性機制。

植物受到外界干擾時防御酶活性會在短時間內提高，如PAL、POD等，一般具有抗性的植物相關酶活性會比感病植物高[47]。研究表明，接種根結線蟲后，抗病水稻的PAL 活性顯著高于感病水稻[48]。此外，黃金玲等[49]研究發現，接種根結線蟲后，抗病柑橘在5～25 d 的PAL 活性一直增高，之后才下降。本研究中，接種象耳豆根結線蟲后，CF25在各時間點的PAL 活性均高于CF29。推測根結線蟲的侵染導致CF25 中PAL 活性的提升，從而增強苯丙烷代謝，產生一系列相關的次生代謝產物，最終提高了對象耳豆根結線蟲的抗性。YANG等[50]對感染根結線蟲的抗、感甘薯進行POD 活性測定，發現抗性甘薯的POD 活性均高于未接種對照。王袁等[51]測定抗、感煙草材料在接種南方根結線蟲后的POD 活性變化發現，在接種14 d 中抗病煙草G28 的POD 活性持續上升，接種第28 天出現二次侵染，其POD 活性再次上升，各時間點G28 的POD 活性始終高于感病材料長脖黃。POD 在植物體內是普遍存在的，在根結線蟲的干擾下，植物產生過量ROS，促使POD活性增強來降低ROS對植物的危害。POD 不僅調節植物活性氧平衡，還有利于木栓蛋白的形成，參與植物機械損傷的修復和細胞壁的形成[52]。本研究中，CF25的POD活性始終高于未接種的對照組和CF29，表明CF25在線蟲入侵后，體內的抗氧化酶系統被激活，從而降低根結線蟲侵染導致的ROS 帶來的危害。同時，POD 是苯丙烷代謝途徑中催化木質素單體生物合成的關鍵酶，推測CF25中POD 活性的升高可能會增強木質素的合成，從而起到加強細胞壁防御屏障的作用。

綜上所述，本研究從組織學和生理生化角度探究了灌木辣椒資源CF25 抗象耳豆根結線蟲的生理基礎，初步判定其抗性機制為抗侵入和抑制進食。未來可以此為基礎深入探究其抗病分子機理，為后續抗病育種提供理論依據。