橡膠樹不同發育時期花藥愈傷生長發育對低溫的響應

關鍵詞：橡膠樹；遺傳轉化；花藥愈傷；低溫保存；體細胞胚發生

中圖分類號：S794.1 文獻標志碼：A

天然橡膠是重要的工業原料，更是不可或缺的戰略物資，其主要來源于巴西橡膠樹（Heveabrasiliensis）。現代遺傳工程的發展、基因組編輯手段的精準改良加速了培育轉基因橡膠樹新品種的腳步，隨之而來的對于轉基因優質受體初代花藥愈傷和初代子葉胚的持續供應成為不可忽視的問題。

橡膠樹公開報道的遺傳轉化體系根據受體分為5 種，原生質體[1]、易碎胚性愈傷組織[2]、花藥愈傷組織[3-5]、次生胚[6]，其中原生質體再生效率低[7]，易碎胚性愈傷組織再生植株生長勢弱[8]，只有花藥愈傷組織和次生胚具有商業應用價值。隨著技術的不斷進步，橡膠樹花藥愈傷組織的遺傳轉化效率在不斷提高。然而花藥愈傷組織為脫分化愈傷，胚性愈傷與非胚性愈傷混合，不能通過繼代增殖，需要不斷采集外植體，但花蕾來源嚴重受季節限制，全年可供采花時期短，不能為相應研究提供長期穩定的受體來源。本文研究了不同發育時期花藥愈傷在15 ℃和20 ℃低溫保存15 d 后，對其愈傷誘導、體細胞胚發生和子葉胚形成的影響，為今后利用低溫保存橡膠樹初代花藥愈傷組織，延長優質胚性愈傷組織、初代子葉胚供應時間，妥善保存橡膠樹種質資源提供理論依據，為以初代花藥愈傷或初代體細胞胚為受體的轉基因研究供體保障提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為大規模推廣級品種橡膠樹熱研73397 春季幼嫩雄花，采自位于海南省儋州市中國熱帶農業科學院橡膠研究所試驗基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體的選擇與接種 從健康的橡膠樹上采集雄性幼花，將有花序的枝條用濕毛巾敷蓋，塑料袋包裹儲存，立即帶回實驗室。用鑷子從花序中挑選黃綠色的胸花在75%的乙醇浸泡1 min，期間搖晃數次，無菌水沖洗1 遍，隨后用0.1%升汞浸泡10 min，期間晃動數次，無菌水沖洗3～5遍。無菌的超凈工作臺中，在顯微鏡下用解剖針剝開花蕾表皮取出完整雄花接種于培養皿中，每皿接種7 個外植體。

1.2.2 橡膠樹低溫保存花藥愈傷及保存后室溫誘導愈傷組織/恢復 共設置花藥愈傷發育時期、保存溫度2 個影響因素。CK 組為一直放置在室溫（25±2） ℃暗培養的花藥愈傷組織。將經過無菌消毒的橡膠樹雄花接種于M1[9]培養基中置于室溫培養得到不同發育時期的花藥愈傷組織（0、7、14、21、28、35、42 d），然后分別放置于15 ℃及20 ℃培養箱中暗培養15 d，觀察低溫處理前后花藥愈傷的表型，隨后放置室溫暗培養。跟蹤不同處理橡膠樹花藥愈傷組織發生及恢復情況，每10 d 觀察各發育時期的花藥愈傷組織發生及恢復情況，30 d 統計愈傷組織誘導率。CK 組室溫暗培養35 d 后統計愈傷組織誘導率。愈傷組織誘導率=（花藥愈傷組織數/低溫培養的花藥數）×100%。愈傷組織延長保存時間（d）=實驗組花藥從外植體接種至可轉入至出胚培養基所需總天數-對照組花藥從外植體接種至可轉入出胚培養基所需總天數。每個處理5 皿，每皿7 個外植體，重復3 次。

1.2.3 橡膠樹低溫保存花藥愈傷組織體細胞胚誘導與成熟 將上述各組花藥愈傷組織轉至體細胞胚誘導培養基M2[9]中，室溫（25±2） ℃暗培養60 d時統計再分化出體細胞胚的花藥愈傷組織數（塊），繼續培養至120 d 時觀察并統計胚狀體及子葉胚數量（個）。以一直置于室溫暗培養的花藥愈傷為CK 組。胚性愈傷誘導率=（誘導出體細胞胚的愈傷數/接種愈傷數）×100%；體細胞胚誘導率=（體細胞胚總數/胚性愈傷數）×100%；子葉胚獲得率=（子葉胚總數/體細胞胚總數）×100%。體細胞胚延長保存時間（d）=實驗組從外植體接種至誘導出子葉胚所需總天數-對照組從外植體接種至誘導出子葉胚所需總天數。

1.3 數據處理

試驗數據主要采用Excel 2023和IBM SPSSStatistics 20軟件進行整理、統計和分析。

2 結果與分析

2.1 低溫保存對不同發育時期橡膠樹花藥愈傷組織生長的影響

結果表明：（1）不同發育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，低溫保存期間，發育時期為0、7、14、21 d 的花藥愈傷無生長跡象，發育時期為28、35、42 d 的花藥愈傷有一定生長，但較CK 組均有不同程度延緩（表1）。愈傷外觀與CK 組相似，未出現明顯冷害（圖1B1、B2）；（2）不同發育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，低溫保存期間，發育時期為0、7 d的花藥愈傷無生長跡象，發育時期為14、21、28、35 d 的花藥愈傷生長情況較CK 組均有不同程度延緩，發育時期為42 d 的花藥愈傷生長情況與CK 組相當。愈傷外觀與CK 組相似，未出現明顯冷害（圖1B3、B4）。

2.2 低溫保存后不同發育時期橡膠樹花藥愈傷組織誘導或恢復情況

室溫條件下，花藥愈傷誘導數為34.33 個，誘導率為98.10%（表1）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，結果表明，在愈傷誘導階段，發育時期為28、35、42 d 的花藥愈傷誘導情況與CK組的差異不顯著。發育時期為7、14 d 的花藥愈傷數及誘導率均顯著下降（P<0.05），分別較CK組降低5～6 個，15.24%和19.05%。發育時期為0、21 d 的花藥愈傷數及誘導率均大幅度下降，分別較CK 組減少16～18 個，45.72%和53.34%（表1）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結果表明，在愈傷誘導階段，發育時期為21、28、35、42 d 的花藥愈傷與CK 組無顯著差異。發育時期為0、7、14 d 的花藥愈傷數及誘導率均顯著下降（P<0.05），降幅分別為4～9個和11.43%～25.72%（表1）。

2.3 低溫保存后不同發育時期橡膠樹花藥胚性愈傷誘導情況

室溫條件下，胚性愈傷數為25.33 個，誘導率為73.84%（表1，圖1D）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，結果表明，在胚性愈傷誘導階段，發育時期為28、42 d 的花藥愈傷其胚性愈傷數、胚性愈傷誘導率與CK 組無顯著差異；其余5 個發育時期與CK 組相比，其胚性愈傷數與胚性愈傷誘導率均顯著下降（P<0.05），降幅分別為6～15個和8.09%～33.26%（表1，圖1D1、D2）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結果表明，在胚性愈傷誘導階段，發育時期為21、42 d 花藥愈傷的胚性愈傷數及胚性愈傷誘導率與CK 組無顯著差異；發育時期為28 d 花藥愈傷的胚性愈傷數與CK 組無顯著差異，胚性愈傷誘導率顯著高于CK 組（P<0.05）；發育時期為0、7、14、35 d 的花藥愈傷其胚性愈傷數及胚性愈傷誘導率均顯著低于CK 組（P<0.05），降幅分別為8～14 個和9.68%～41.90%（表1）。

2.4 低溫保存后不同發育時期的花藥愈傷組織體細胞胚發生情況

室溫條件下，體細胞胚數為87.33個，體細胞胚誘導率為345.15%（表1，圖1D）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，結果表明，在體細胞胚發生階段，發育時期為14、42 d 的花藥愈傷產生的體細胞胚數與CK 組無顯著差異，而其他5 個發育時期花藥愈傷產生的體細胞胚數較CK 組顯著下降，降幅為13～62 個；發育時期為14、21 d 的花藥愈傷體細胞胚誘導率較CK 組有顯著提高（P<0.05），分別提高了111%和178.49%；發育時期為35 d的花藥愈傷的體細胞誘導率顯著降低（P<0.05），較CK 組下降159.17%，而其余4 個時期的花藥愈傷體細胞胚誘導率與CK 組無顯著差異（表1，圖1D1、D2）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結果表明，在體細胞胚發生階段，發育時期為21、28、42 d 的花藥愈傷體細胞胚數顯著高于CK 組（P<0.05），增幅為10～38 個；發育時期為0、7、14、35 d 的花藥愈傷體細胞胚數較CK 組顯著下降（P<0.05），降幅為20～70 個；發育時期為0、14、42 d 的花藥愈傷體細胞胚誘導率比CK 組顯著提高（P<0.05），增幅為95.60%～155.53%；發育時期為7、21、28 d 的花藥愈傷體細胞胚誘導率與CK 組無顯著差異；發育時期為35 d 的花藥愈傷的體細胞胚誘導率對比CK 組下降180.76%，差異最為顯著（P<0.05）（表1，圖1D3、D4）。

2.5 低溫保存后不同發育時期花藥愈傷組織子葉胚獲得情況

對照組的子葉胚數為23.33個，子葉胚獲得率為26.58%（表1，圖1E）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15d，結果表明，在子葉胚獲得方面，發育時期為21 d 的花藥愈傷子葉胚數比CK 組顯著提高（P<0.05），較CK 組多約6 個，發育時期為14、28、42 d 的花藥愈傷子葉胚數與CK 組無顯著差異，發育時期為0、7、35 d 的花藥愈傷子葉胚數較CK 組顯著下降（P<0.05），降幅為11～19個；發育時期為0、21 d 的花藥愈傷子葉胚獲得率對比CK 組顯著提高（P<0.05），分別較CK 組提高了11.41%和25.29%，而其余5 個發育時期的花藥愈傷子葉胚獲得率較CK 組無顯著差異（表1，圖1E1、E2）。

不同發育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結果表明，在子葉胚獲得方面，發育時期為21、42d的花藥愈傷子葉胚數比CK 組顯著提高（P<0.05），分別較CK 組增加約7 個和18 個，發育時期為0、7、28d的花藥愈傷子葉胚數與CK 組無顯著差異，發育時期為14、35d的花藥愈傷子葉胚獲得數較CK 組顯著下降（P<0.05），分別較CK 組減少約13 和20 個；發育時期為21 d 的花藥愈傷子葉胚獲得率對比CK 組顯著性提高（P<0.05），較CK 組提高了15.58%，而其余6個發育時期的花藥愈傷子葉胚獲得率與CK 組無顯著差異（表1，圖1E3、E4）。

2.6 低溫保存溫度與花藥愈傷發育時期對低溫保存后花藥愈傷誘導、分化、發育影響

圖2表明，不同低溫保存的花藥愈傷在各發育階段生長狀況，15 ℃低溫保存后的花藥愈傷組織在胚性愈傷誘導階段的胚性愈傷數較CK 組顯著下降（P<0.05），其余生長階段與CK 組無顯著差異；20 ℃低溫保存后的花藥愈傷組織在各生長階段與CK 組均無顯著差異。

圖3表明，不同發育時期的花藥愈傷低溫保存后在各發育階段生長狀況，在愈傷誘導階段（愈傷誘導數和愈傷誘導率），發育時期為28、35、42 d 的花藥愈傷組織與CK 組無顯著差異，而其余4 個發育時期的花藥愈傷組織較CK 組顯著下降；在胚性愈傷誘導階段（胚性愈傷數和胚性愈傷誘導率），發育時期為28、42 d 的花藥愈傷組織與CK 組無顯著差異，而其余5 個發育時期的花藥愈傷組織較CK 組顯著下降（P<0.05），但其中發育時期為21 d 的花藥愈傷組織的胚性愈傷數顯著下降（P<0.05），胚性愈傷誘導率與CK 組確無顯著差異；在體細胞胚誘導階段，發育時期為14、21、28、42 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚數與CK 組無顯著差異，而其余3 個發育時期的體細胞胚數較CK 組顯著下降（P<0.05）、發育時期為14、21 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚誘導率較CK 組顯著提高（P<0.05），發育時期為0、7、28、42 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚誘導率與CK 組無顯著差異，發育時期為35 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚誘導率較CK 組顯著下降（P<0.05）；在子葉胚形成階段，發育時期為21 d 花藥愈傷組織的子葉胚數較CK 組顯著提高（P<0.05），發育時期為0、28、42 d 的花藥愈傷組織的子葉胚數與CK 組無顯著差異，其余3 個發育時期的花藥愈傷組織的子葉胚數較CK 組顯著下降（P<0.05）、發育時期為0、21 d 花藥愈傷組織的子葉胚獲得率較CK 組顯著提高（P<0.05），發育時期為7、14、28、42 d 的花藥愈傷組織的子葉胚獲得率與CK組無顯著差異，發育時期為35 d 的花藥愈傷組織的子葉胚獲得率較CK 組顯著下降（P<0.05）。

3 討論

3.1 低溫保存將全年花藥愈傷供應時間從60d延長至240d

花藥愈傷組織是良好的遺傳轉化受體，馬來西亞[10-12]、印度[4]、我國[13]均通過轉化花藥愈傷組織獲得了轉基因植株。然而花藥愈傷組織為脫分化愈傷組織，不能通過繼代增殖，需不斷采集外植體。橡膠樹花期集中，不同地區橡膠樹一年開花2～3 次，每次雄花花期20 d 左右。室外采集外植體的另一個問題是污染率與氣候密切相關，白粉病高發季節外植體污染率高達50%以上，而晴天外植體污染率低于10%。因此在晴天采集外植體誘導愈傷組織，并通過物理化學方式限制其生長，延長愈傷組織供應時間對遺傳轉化研究具有重要意義。

限制生長保存的方式有降低培養環境的氧氣含量、添加滲透調節劑或生長抑制劑、膠囊化或脫水、降低培養溫度[14]，其中降低培養溫度減慢細胞代謝活動的同時，存活率高、操作簡單、方便，使用較多。橡膠樹不同愈傷發育時期（0、7、14、21、28 d）、低溫保存溫度（15、20 ℃）可以延長花藥初代愈傷供應時間15～60 d，子葉胚供應時間27～95 d。最優方案為發育時期為21 d 的花藥愈傷在15 ℃低溫下保存15 d，可延長花藥愈傷和初代子葉胚供應60 d 和60～95 d，該處理雖然降低了46.61%愈傷數，但促進了子葉胚形成，子葉胚數提高了27.18%，達顯著水平。說明以該處理低溫保存的花藥愈傷為侵染受體，在侵染量減少46.61%的情況下，其子葉胚數可提高27.18%，大大提高遺傳轉化工作效率。近年來，低溫保存結合抗氧化劑、低含氧量等方法實現在胚性愈傷組織[15-16]、莖尖培養物[17]、花粉[18]、種子[19-20]、體細胞胚[21]、微型塊莖[22]、帶芽莖段[23]等組織、器官，植株[24]的中短期保存，保存溫度在1～20 ℃，保存時間21 d 至18 個月。通過18 ℃+90 g/L 蔗糖+2 mg/L ABA+10 μmol/（m2·s）低光照可保存棗椰體細胞胚10 個月，存活率接近100%，體細胞胚增殖率高于室溫[21]。通過4～5 ℃+抗氧化劑可保存橡膠樹易碎胚性愈傷25 d，存活率與室溫相近，且恢復后愈傷細胞活力更強，植株誘導率高于對照組50%，達顯著水平[25]。但橡膠樹易碎胚性愈傷組織誘導時間較長，再生植株生勢弱，沒有商業價值[8]。

3.2 低溫保存適當發育時期花藥愈傷促進了子葉胚形成

在15 ℃和20 ℃低溫保存后，發育時期為21 d的花藥愈傷子葉胚獲得數和子葉胚獲得率與對照組相比均有顯著提高， 子葉胚數分別提高了27.18%和77.15%。子葉胚獲得率分別提高了25.29%和15.58%。而35 d 的花藥愈傷，15 ℃和20 ℃低溫保存后，在愈傷發生階段與對照組無顯著差異，但在體細胞胚發生和子葉胚形成階段與對照組差異顯著，特別是子葉胚形成階段，子葉胚獲得數分別下降了82.85%和85.73%，子葉胚獲得率分別下降了9.98%和7.97%，幾乎無法獲得子葉胚。橡膠樹花藥愈傷誘導和體細胞胚發生對溫度非常敏感，在愈傷誘導和分化為球形原胚的過程，26 ℃體細胞胚數是24 ℃的2.86 倍，而在球形原胚發育為子葉胚的過程，24 ℃的體細胞胚數是22 ℃的1.60 倍，是28 ℃的1.25 倍，且28 ℃導致正常胚比例下降[26]。橡膠樹花藥愈傷誘導子葉胚經歷5 步：外植體脫分化形成愈傷組織（0～21 d）、體細胞分化為胚性母細胞（21～28 d）、胚性母細胞經多次分裂為多細胞原胚（28～42 d）、多細胞原胚發育為球形胚（42～49 d）、球形胚進一步發育成子葉胚（52～72 d）[27]。因此，21 d 處于體細胞分化為胚性母細胞時期，此時進行低溫處理，有助于篩選掉胚性弱或畸形的胚性母細胞，提高正常胚性母細胞比例，這些細胞在后續發育為子葉胚過程，少了畸形胚的競爭，營養供應更充分，因此，21 d 花藥愈傷經低溫處理后子葉胚數及子葉胚獲得率大幅提高。而35 d 的花藥愈傷處于多細胞原胚階段，對溫度非常敏感，推測低溫不利于胚性母細胞發育為多細胞原胚，因此低溫處理后，35 d 的花藥愈傷體細胞胚數和子葉型體胚數及體細胞胚誘導率和子葉型體細胚誘導率大幅下降。低溫提高正常胚比例在牡丹[28]、水曲柳[29]、大豆[30]、鴨茅草[31]也有發現。后續將通過解剖學進一步驗證。

4結論

（1）在15 ℃和20 ℃低溫保存15 d 后愈傷誘導、體細胞胚發生各階段除胚性愈傷數顯著低于對照組外，其余指標與對照組無顯著差異，15 ℃低溫保存各階段指標均低于20 ℃，但差異不顯著；（2）發育時期對低溫保存后愈傷誘導、體細胞胚發生各階段均有顯著影響，對子葉胚形成階段影響最大，其中21 d 花藥愈傷組織經低溫保存其子葉胚數量顯著高于對照組，35 d 花藥愈傷組織經低溫處理后子葉胚數量顯著低于對照組（P<0.05）。（3）15 ℃和20 ℃低溫保存15 d 不同發育時期花藥愈傷組織與對照組相比，可延長花藥初代愈傷供應時間15～60 d，初代子葉胚供應時間27～95 d。最優方案為發育時期為21 d 的花藥愈傷在15 ℃低溫下保存15 d，可延長花藥愈傷和初代子葉胚供應60 d 和60～95 d，該處理雖然降低了46.61%愈傷數，但促進了子葉胚形成，子葉胚數提高了27.18%。本研究實現了橡膠樹花藥愈傷的短期保存，有效解決了因花期短導致遺傳轉化受體來源不足的困難，全年3 個花季延長受體（花藥愈傷）供應時間180 d，加上花季60 d，全年可開展實驗時間由60 d 延長至240 d，有助于加快橡膠樹花藥愈傷遺傳轉化體系優化研究。