利用酵母雙雜交篩選菠蘿AcSWEET11的互作蛋白

關鍵詞：菠蘿；AcSWEET11；酵母雙雜交；互作蛋白

中圖分類號：S668.3 文獻標志碼：A

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]是世界重要的熱帶果樹之一，也是我國重要的熱帶經濟作物。菠蘿是聚花果植物，花芽分化一旦開始，花序和果實的發育就會持續下去，直到果實成熟[1]，成花與否決定了菠蘿產量與品質的形成。目前，生產中菠蘿的開花途徑有2 個，一是經過冬季低溫后自然成花[2]，二是栽培12～16個月后經人工誘導成花。自然開花會導致果實成熟期不一致，收獲期延長，甚至出現部分植株3～4a才能自然開花的現象，限制了菠蘿產業的發展[3]。為了解決這一問題，生產上主要利用乙烯利、電石等乙烯衍生物對菠蘿進行人工誘導成花（催花）達到產期調節的效果[4] ，但催花效果受到品種、環境條件和菠蘿的生長發育時期的影響。如果催花不當，會造成減產、果實品質下降，甚至是絕收的情況，嚴重影響了經濟效益，阻礙了產業的升級[5] 。因此，解析菠蘿的成花機制，對促進菠蘿產期的調節具有重要意義。

SWEET 廣泛存在于植物體，在植物的許多生理過程中發揮著重要的作用。自2010年CHEN等[6]從擬南芥中第一次鑒定出糖轉運蛋白基因SWEET 以來，通過對已經發表的基因組序列進行全基因組檢索分析，在多種植物中鑒定到了大量的SWEETs[7-9]。SWEET 屬于MtN3/saliva 家族，膜內區域高度保守，具有雙向轉運糖的功能，包含7 個跨膜a-螺旋結構，形成三螺旋束，促進糖的跨膜運輸[10]。不同植物的SWEET 系統進化分析結果表明，在植物中SWEET 基因家族可以分為4 個亞類，且每個亞類的主要轉運底物不同：Ⅰ 亞類主要轉運脫氧葡萄糖， 擬南芥的AtSWEET1 是第一個以糖轉運為特點的糖轉運蛋白，具有葡萄糖的轉運活性，參與花粉對單糖的吸收[11]；Ⅱ亞類主要轉運單糖，葡萄VvSWEET4主要負責葡萄糖的轉運，水稻OsSWEET5 參與半乳糖轉運[11-12]；Ⅲ亞類主要轉運蔗糖，擬南芥AtSWEET11 和AtSWEET12 負責將細胞內的蔗糖流出到細胞壁間隙進而裝載到韌皮部用于蔗糖的長距離運輸[13]；而Ⅳ亞類主要介導了果糖的單向運輸，AtSWEET17 定位到液泡膜上，外部供應果糖時，其在根延伸區高度表達，促進根從外部吸收果糖，介導液泡對果糖的攝取并儲存[14-15]。SWEETs 調控植物花器官的發育，在植物開花過程中發揮著重要的調控作用。在水稻中OsSWEET11在圓錐花序和花藥中高表達，遺傳轉化研究結果表明OsSWEET11 調控小孢子在花粉母細胞階段和未成熟花粉的發育。OsSWEET11 通過降低花粉發育過程中淀粉的含量導致育性下降[7]。OsSWEET14 基因敲除后，突變植株的種子變小，生長延緩，植株的生殖發育延遲[16]。一些研究結果表明SWEETs 不僅能夠影響植物的育性，在植物的花器官形成過程中也起著重要的作用。通過分析牡丹花花器官形成過程中葡萄糖含量變化和PsSWEET 表達量變化發現，PsSWEET8 極可能通過調控牡丹花瓣葡萄糖的轉運從而調控開花過程[17]。最新的研究表明，在長日照條件下超表達AtSWEET10 后擬南芥提前開花，進一步的研究結果表明AtSWEET10 位于FT 信號途徑的下游[18]，這是首次有直接證據證明SWEET參與了植物成花轉變的過程。但是AtSWEET10 是如何調控開花的機制尚不清楚。因此，推測AtSWEET10 可能在FT 的誘導下進行轉錄然后運輸糖或者FT 蛋白來促進開花[18]。

已有研究表明，菠蘿（無刺卡因）成花過程中可溶性糖和蔗糖含量顯著提高[19]，且本課題組前期研究結果證實，AcSWEET11 能夠促進果實糖積累[20]，并能促進擬南芥提早開花（待發表），但其在成花中的作用機制尚不清楚。本研究利用酵母雙雜交技術， 篩選菠蘿花芽分化過程的cDNA 文庫中與AcSWEET11 互作的候選蛋白，為進一步研究AcSWEET11 參與成花調控的機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母粉（yeast extract）和胰蛋白胨（tryptone）購自OXOID 公司；缺陷培養基（minimal syntheticaldefined medium， SD）DDO（SD/-Leu/-Trp）、TDO（ SD/-Leu/-Trp/-His ）、TDO/X（ SD/-Leu/-Trp/-His/X-a-gal）、QDO（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）和YPDA 培養基購自北京索萊寶科技有限公司；X-a-gal 購自YEASEN 公司；酵母菌株感受態NMY51 和pBT3、pNubG-Fe65、pTSU2-APP、pPR3等載體購自武漢金凱瑞生物工程有限公司；菠蘿花芽的cDNA 文庫由本研究中心保存。

1.2 方法

1.2.1 誘餌載體的毒性和自激活檢測 毒性和自激活檢測方法參照王會勤[21]的方法。以pNubGFe65和pTSU2-APP 共轉化NMY51 酵母菌為陽性對照，pPR3-N 和pTSU2-APP 共轉化酵母菌為陰性對照。將pBT3-STE-AcSWEET11 和獵物空載pPR3-N 通過LiAc 的方法共轉化至酵母NMY51中，在DDO、TDO、TDO/AT 和QDO 培養基上30 ℃培養3～4 d，觀察菌落的生長情況，檢測pBT3-STE-AcSWEET11 誘餌蛋白的毒性和自激活活性。通過對pBT3-STE-AcSWEET11 和Post-Nubal 共轉化NMY51 酵母菌，在DDO、TDO/3?AT和QDO 培養基上培養，觀察菌落的生長情況，檢測pBT3-STE-AcSWEET11 在酵母NMY51 中的表達功能。

1.2.2 互作蛋白的篩選 從SD/-Leu 平板挑取生長狀態良好、含有pBT3-STE-AcSWEET11 的單克隆接種至50 mL 的SD/-Leu 液體培養基，30 ℃培養至OD600 為0.2 后，轉接至YPDA 液體培養基中，震蕩培養，使OD600 為0.6～0.8（12～16 h）；室溫離心，收集菌體，用無菌水重懸，離心后棄上清；加入LiAc 重懸菌體，混勻，置冰上，制備含有誘餌載體的NMY51 感受態。將菠蘿cDNA文庫質粒轉化含有誘餌載體的NMY51 感受態后，均勻涂布于TDO/X/3?AT 5 mmol/L 平板上，30 ℃培養3～4 d。挑選TDO/X/3?AT 板上變藍的單菌落，轉接于新的QDO/X 平板上，30 ℃培養3 d，統計2 種培養基上變藍的單菌落，即為候選陽性克隆。

1.2.3 候選互作蛋白的測序鑒定 提取陽性克隆質粒，利用通用引物（Up： CTTTCCTTATACATTAGGACC，Dn： GGGACCTAGACTTCAGGTTG）進行PCR 擴增。選取條帶單一，大于500 bp 的有效克隆片段，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。測序結果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫上進行BLAST 比對分析。

1.2.4 生物信息學分析 利用在線網站UniProt（https：//www.uniprot.org）注釋候選蛋白的功能。將獲得的候選蛋白進行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析。

1.2.5 候選蛋白基因的表達分析 對乙烯利誘導菠蘿成花過程（0、8、16、32 d）進行轉錄組測序，獲得花芽分化過程中基因表達量的數據，利用HemI 軟件計算各時期基因表達量的FPKM（fragments per kilobase of exon model per millionmapped fragments）值，并繪制候選蛋白基因在乙烯利誘導菠蘿成花過程中的表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 誘餌載體的毒性和自激活檢測

以pNubG-Fe65 和pTSU2-APP 共轉化NMY51 酵母菌為陽性對照，pPR3-N 和pTSU2-APP 共轉化酵母菌為陰性對照。將pBT3-STEAcSWEET11誘餌重組質粒和獵物空載pPR3-N 共轉化NMY51 酵母感受態。結果表明，pBT3-STEAcSWEET11+pPR3-N 在DDO 培養基上的酵母菌生長狀態良好，說明pBT3-STE-AcSWEET11 和pPR3-N 已成功轉入NMY51 酵母菌中，且對NMY51 酵母細胞無毒性。pNubG-Fe65+pTSU2-APP 在DDO、TDO/3?AT、QDO 培養基上生長良好，pPR3-N+pTSU2-APP 在DDO 培養基上正常生長，在TDO/3?AT、QDO 無菌落生長，誘餌重組質粒pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N的酵母菌在TDO 培養基能夠生長， 表明pBT3-STE- Ac-SWEET11+pPR3-N 有自激活現象，激活HIS3 的表達（圖1A～圖1H）。為了抑制酵母菌中HIS3的表達，在TDO 培養基中添加不同濃度的3?AT。結果顯示，在添加3?AT 后酵母菌沒有生長，HIS3的表達受到抑制（圖1I～圖1K）。進一步分析其在QDO 培養基上的生長情況，結果顯示，轉化pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 的酵母菌不能生長（圖1L）。以上結果表明，pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 在TDO/3?AT 培養基和QDO培養基上自激活受到抑制，后續可在TDO/3?AT 和QDO 培養基上進行互作蛋白的篩選。

將Post-Nubal 和pBT3-STE-AcSWEET11 共轉化NMY51 酵母菌，分別在DDO、TDO/3?AT 和QDO 培養基上培養。結果表明，在DDO 培養基上有菌落生長，說明共轉化成功；在TDO/3?AT和QDO 培養基上菌落生長良好，表明pBT3-STEAcSWEET11在NMY51 系統能正確表達，可進行下一步文庫篩選（圖2）。

2.2 候選互作蛋白的篩選及鑒定

利用菠蘿花芽分化的cDNA 膜文庫篩選與AcSWEET11 互作的蛋白。以pTSU2-APP和pNubGFe65共轉化菌液為陽性對照（CK+），pTSU2-APP和pPR3-N 共轉化菌液為陰性對照（CK–），經過2 次篩選，共獲得81 個在TDO/X/3?AT 培養基中生長良好的藍色菌落（圖3A、圖3B）。進一步加壓培養，將58 個大小均一的單克隆點種在含有QDO/X 培養基上進行再次篩選。結果顯示，58個藍色菌斑均能正常生長（圖3C、圖3D），初步篩選出58 個陽性克隆。將這58 個陽性克隆進行菌落PCR 反應（pPR3-N 為陽性對照，CK+；H2O為陰性對照，CK–），電泳檢測結果表明，插入片段條帶單一，大小約為500～2000 bp（圖4）。分別提取陽性克隆質粒并進行測序分析，合并重復序列，測序結果在NCBI 進行比對，篩選到48 個可能與AcSWEET11 相互作用的蛋白（表1）。主要包括E3 泛素連接酶RING1-like、海藻糖磷酸合成酶、細胞色素P450、LUX 轉錄因子等。

2.3候選蛋白的生物信息學分析

對獲得的48個候選互作蛋白進行GO 和KEGG 分類分析。GO分析結果表明，48個蛋白主要富集在細胞進程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、刺激反應（responsetostimulus）、細胞解剖實體（cellular anatomicalentity）、結合（binding）和催化活性（catalyticactivity）等生物過程（圖5）。KEGG 分析結果顯示，48 個蛋白主要的KEGG 途徑包括脂類代謝（lipid metabolism）、氨基酸代謝（amino acidmetabolism）、其他次生代謝物的生物合成（biosynthesisof other secondary metabolites）和碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）等新陳代謝途徑，翻譯（translation）和折疊、分類和降解（folding，sorting and degradation）等遺傳信息途徑，以及信號轉導（signal transduction）與運輸和分解代謝（transport and catabolism）等通路（圖6）。

2.4 候選蛋白的基因表達分析

為了確定候選互作蛋白基因的表達情況，對前期獲得的菠蘿花芽分化過程中的轉錄組數據進行分析，結果表明，共有30 個候選蛋白基因檢測到表達量，18個候選蛋白基因在乙烯利誘導菠蘿成花中未檢測到。進一步分析結果表明，Trehalosephosphatesynthase 7（XP_020105459.1）、ProteinTIFY 3-like（XP_020082835.1）、40S ribosomal proteinS27（XP_020092770.1）、Heterogeneous nuclearribonucleoprotein 1-like（XP_020112516.1）等4 個基因與AcSWEET11（XP_020107765.1）表達一致，在菠蘿成花過程中下調表達；Dihydrolipoyl dehydrogenase2（XP_020113798.1）、Putative lipidtransferprotein DIR1（XP_020086640.1）、Clathrinassembly protein At4g32285（XP_020108161. 1）等3個基因在菠蘿成花過程中上調表達（圖7）。表明Trehalose-phosphate synthase 7 等7 個候選互作蛋白在菠蘿成花過程中具有重要作用。

3 討論

酵母雙雜交是一種篩選互作蛋白的常用方法，廣泛應用于未知互作蛋白的篩選和已知蛋白間相互作用的驗證。但該系統存在假陽性率和假陰性率高等局限性[22]。自激活和毒性是導致假陽性率和假陰性率高的主要因素。當誘餌蛋白和獵物蛋白單獨或結合后，出現毒性，抑制酵母細胞的正常生長，從而出現假陰性；而當誘餌蛋白存在自激活活性，獵物蛋白與誘餌蛋白結合后可激活報告基因的表達，從而出現假陽性[23]。為了抑制誘餌蛋白的自激活活性，不同缺陷培養基以及在缺陷培養基中添加不同濃度3?AT 被廣泛應用于酵母雙雜交的過程中。謝瑞瑩等[23]通過在TDO培養基中添加10 mmol/L 的3?AT，抑制了pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7 的自激活活性；在葡萄中，將pGBKT7-VvJAZ9+pGADT7 在QDO/X/A 的培養基上培養，其自激活活性受到抑制[24]。本研究結果顯示，pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 存在自激活現象，通過在TDO培養基中添加不同濃度的3?AT 后或在QDO培養基上培養，酵母菌不能生長，表明3?AT 和QDO培養基能夠抑制pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 的自激活活性。

菠蘿花芽分化是一個復雜的生物學過程，受到自身因素和外界環境條件的影響，涉及糖、氨基酸、植物激素等生理生化的變化[19， 25-26]。本課題組的前期研究結果表明，AcSWEET11可促進可溶性糖的積累[20]，但其在成花中的作用機制尚不清楚。本研究利用酵母雙雜交技術，篩選了48 個與AcSWEET11互作的蛋白，這些蛋白主要富集在氨基酸、碳水化合物以及信號轉導和運輸、分解等代謝通路上，推測AcSWEET11可能通過氨基酸、碳水化合物和信號轉導等途徑參與菠蘿的成花過程。

擬南芥AtSWEET10 能夠促進擬南芥提早開花，且處于FT 的下游[18]。在本研究中，沒有篩選到FT 等成花相關的基因，推測AcSWEET11 可能不是通過直接與FT 等成花相關基因相互作用參與菠蘿的成花過程。Trehalose-phosphate synthase（TPS）基因在擬南芥成花啟動中具有重要作用，其主要通過調控SPL 等基因的表達參與擬南芥的成花過程，是糖作為信號物質參與成花的關鍵途徑[27]。本研究結果表明，AcSWEET11 和AcTPS7能夠產生互作，且其在菠蘿成花過程中的表達模式一致，推測AcSWEET11 可能通過TPS 信號途徑參與菠蘿成花。乙烯是誘導菠蘿成花的關鍵激素，外源乙烯通過促進內源乙烯的合成誘導菠蘿成花[4]。已有報道表明E3 泛素連接酶（E3 ubiquitin-protein ligase RING1）能直接與ACS 合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase）相互作用來調節乙烯的合成[28]。本研究結果顯示，AcSWEET11 和E3 泛素連接酶存在互作，推測AcSWEET11 可能通過與E3 泛素連接酶互作來調控乙烯的合成參與菠蘿的成花過程。此外，本研究還篩選到了1個LUX 轉錄因子。在水稻中，OsLUX 通過調控OsELF3-1 和OsELF4s 蛋白抑制Hd1/Ghd7 的表達參與成花[29]。而在菠蘿中，AcSWEET11是否與水稻相似，能夠通過與LUX相互作用，調控ELF 等蛋白的表達來參與菠蘿的成花過程，需要進一步研究。

4結論

本研究通過對pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 的毒性和自激活活性的檢測，建立AcSWEET11的酵母雙雜交系統。利用該系統篩選了48個與AcSWEET11互作的候選蛋白。對48 個蛋白進行GO和KEGG分析，其主要分布在細胞進程、代謝過程、刺激反應和催化活性等生物過程，參與氨基酸代謝、碳水化合物代謝和信號轉導和運輸等新陳代謝途徑，推測AcSWEET11 可能通過氨基酸代謝、碳水化合物代謝或者信號轉導等途徑參與菠蘿的成花過程。