HPLC法同時測定復方磷酸可待因口服溶液中3種有效成分及2種防腐劑的含量

魏文芝 王天學 張敏娟

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）18-2501-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.18.13

摘 要 目的：建立同時測定復方磷酸可待因口服溶液中3種有效成分（磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏）及2種防腐劑（苯甲酸鈉、羥苯乙酯）含量的方法。 方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為GL·Science WondaSil C18-WR，流動相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含2.5 mmol/L庚烷磺酸鈉和0.1%三乙胺，用磷酸調節pH至2.5±0.1）（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。 結果：磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉、羥苯乙酯檢測質量濃度線性范圍分別為0.365 8～457.20 μg/mL（r=0.999 9）、0.363 5～454.35 μg/mL（r=0.999 9）、0.124 8～155.98 μg/mL（r=0.999 9）、0.390 6～488.25 μg/mL（r=0.999 9）、0.121 3～151.65 μg/mL（r=0.999 9）；定量限分別為0.409 4、0.508 8、7.731 4、1.347 6、1.940 8 ng，檢測限分別為0.146 2、0.181 7、2.494 0、0.449 2、0.606 5 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于1%；加樣回收率分別為98.10%～101.96%（RSD=1.4%，n=9）、97.65%～101.14%（RSD=1.2%，n=9）、97.30%～102.30%（RSD=1.8%，n=9）、97.71%～102.21%（RSD=1.5%，n=9）、97.03%～101.55%（RSD=1.7%，n=9）。 結論：該方法操作簡單，精密度、穩定性、重復性均較好，可用于同時測定復方磷酸可待因口服溶液中磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉和羥苯乙酯的含量。

關鍵詞 復方磷酸可待因口服溶液；高效液相色譜法；磷酸可待因；鹽酸麻黃堿；馬來酸氯苯那敏；苯甲酸鈉；羥苯乙酯；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 3 active components as codeine phosphate， ephedrine hydrochloride， chlorphenamine maleate and 2 preservatives as sodium benzoate and ethylparaben in Compound codeine phosphate oral solution. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on GL·Science WondaSil C18-WR column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.01 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （containing 2.5 mmol/L sodium heptane sulfonate and 0.1% triethylamine， pH adjusted to 2.5±0.1 with phosphoric acid） （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 210 nm and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of codeine phosphate， ephedrine hydrochloride， chlorphenamine maleate， sodium benzoate and ethylparaben were 0.365 8-457.20 μg/mL （r=0.999 9）， 0.363 5-454.35 μg/mL （r=0.999 9）， 0.124 8-155.98 μg/mL （r=0.999 9）， 0.390 6-488.25 μg/mL （r=0.999 9）， 0.121 3-151.65 μg/mL（r=0.999 9）， respectively. The limits of quantitation were 0.409 4， 0.508 8， 7.731 4， 1.347 6， 1.940 8 ng； the limits of detection were 0.146 2， 0.181 7， 2.494 0， 0.449 2， 0.606 5 ng. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 1%. The average recoveries were 98.10%-101.96%（RSD=1.4%，n=9）， 97.65%-101.14%（RSD=1.2%，n=9）， 97.30%-102.30% （RSD=1.8%，n=9）， 97.71%-102.21%（RSD=1.5%，n=9）， 97.03%-101.55%（RSD=1.7%，n=9）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， precise， stable and reproducible， and it can be used for simultaneous determination of codeine phosphate， ephedrine hydrochloride， chlorphenamine maleate， sodium benzoate and ethylparaben in Compound codeine phosphate oral solution.

KEYWORDS Compound codeine phosphate oral solution； HPLC； Codeine phosphate； Ephedrine hydrochloride； Chlorphenamine maleate； Sodium benzoate； Ethylparaben； Content determination

復方磷酸可待因口服溶液為復方口服制劑，主要成分為磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、氯化氨，為臨床常用鎮咳類藥物，對急、慢性咳嗽均具有良好的治療效果[1-2]。該藥現行質量標準為國家藥品標準WS1-（X-098）-2002Z，收載于《國家食品藥品監督管理局國家藥品標準新藥轉正標準》（第3冊）[3]，但該標準未對其中防腐劑的含量進行控制。復方磷酸可待因口服溶液中添加的防腐劑多為苯甲酸鈉和羥苯乙酯，防腐劑雖能夠抑制微生物在口服溶液中的生長和繁殖，但過量攝入會對人體造成危害[4-7]，故應對其中防腐劑的含量加以控制。另其原標準中磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏需采用兩種色譜系統分別進行含量測定，操作較煩瑣。因此，筆者參考相關文獻[8-17]，建立了采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定復方磷酸可待因口服溶液中磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉和羥苯乙酯含量的方法，旨在為其質量控制提供參考，在保證患者用藥安全的同時降低檢驗成本。

1 材料

1.1 儀器

e2695-2998型HPLC儀，包括Empower 3色譜工作站、二極管陣列檢測器等（美國Waters公司）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

磷酸可待因對照品（批號：171203-201306，純度：100%）、鹽酸麻黃堿對照品（批號：171241-201007，純度：100%）、馬來酸氯苯那敏對照品（批號：100047- 200606，純度：99.7%）、苯甲酸鈉對照品（批號：100433- 200301，純度：100%）、羥苯乙酯對照品（批號：100847- 201203，純度：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；復方磷酸可待因口服溶液（生產廠家A，批號：130619、130620、130621，規格：120 mL/瓶；生產廠家B，批號：B20120102、B20120105，規格：60 mL/瓶；生產廠家B，批號：B20120815、B20121207，規格：120 mL/瓶）；庚烷磺酸鈉（德國Merck公司，純度：≥99.0%）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；磷酸二氫鉀（分析純，天津市百世化工有限公司）；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：GL·Science WondaSil C18-WR（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含2.5 mmol/L庚烷磺酸鈉和0.1%三乙胺，用磷酸調節pH至2.5±0.1）（B），梯度洗脫（0～40 min，15% A→30% A；40～45 min，30% A→15% A；45～50 min，15% A）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取磷酸可待因對照品0.030 48 g、鹽酸麻黃堿對照品0.030 29 g、馬來酸氯苯那敏對照品0.010 43 g、苯甲酸鈉對照品0.032 55 g、羥苯乙酯對照品0.010 11 g，分別置于10 mL量瓶中，加入乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含2.5 mmol/L庚烷磺酸鈉和0.1%三乙胺，用磷酸調節pH至2.5±0.1）（15 ∶ 85，V/V，以下簡稱“溶劑”）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成單一對照品貯備液。分別精密量取上述單一對照品貯備液各3 mL，置于同一20 mL量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品10 mL，置于100 mL量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 以溶劑作為陰性對照溶液。

2.2.4 加樣回收率試驗用混合對照品溶液 精密稱取磷酸可待因對照品24.65 mg、鹽酸麻黃堿對照品20.19 mg、苯甲酸鈉對照品51.19 mg、羥苯乙酯對照品12.64 mg，置于同一10 mL量瓶中；另精密稱取馬來酸氯苯那敏對照品24.56 mg，置于50 mL量瓶中，加入溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置于上述10 mL量瓶中；加入溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置于50 mL量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得加樣回收率試驗用混合對照品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉、羥苯乙酯峰之間的分離度均大于1.5，各成分峰理論板數均大于5 000，且陰性對照對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.016、0.08、0.4、2、10 mL，分別置于20 mL量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，得線性關系工作溶液1～5；另取“2.2.1”項下混合對照品溶液20 mL，作為線性關系工作溶液6。取上述線性關系溶液1～6各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結果，磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉、羥苯乙酯的定量限分別為0.409 4、0.508 8、7.731 4、1.347 6、1.940 8 ng，檢測限分別為0.146 2、0.181 7、2.494 0、0.449 2、0.606 5 ng。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉、羥苯乙酯峰面積的RSD分別為0.4%、0.2%、0.3%、0.4%、0.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：130619）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉、羥苯乙酯峰面積的RSD分別為0.08%、0.11%、0.20%、0.04%、0.20%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

精密量取樣品（批號：130619）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉、羥苯乙酯的平均含量分別為0.985、0.788、0.195 0、2.050、0.489 mg/mL，RSD分別為0.4%、0.7%、0.5%、0.6%、0.6%（n=6），表明本方法重復性較好。

2.9 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的樣品（批號：130619）0.5 mL，共9份（每份約相當于含磷酸可待因45.25 μg、鹽酸麻黃堿39.40 μg、馬來酸氯苯那敏0.99 μg、苯甲酸鈉102.50 μg、羥苯乙酯24.45 μg），分別置于100 mL量瓶中，精密加入“2.2.4”項下加樣回收率試驗用混合對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品含量測定

取各批樣品適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按外標法以峰面積計算樣品含量，結果見表3。

3 討論

口服溶液為臨床常用劑型，因其加入矯味劑，患者用藥依從性較好，尤其是對于兒童或吞咽困難的患者。但因口服溶液為多劑量包裝產品，為防止發霉、酸敗、變色、產生氣體或其他變質等情況，需加入防腐劑。而防腐劑（尤其是對羥基苯甲酸酯類防腐劑）對人體的危害較大（如干擾內分泌、影響男性生殖系統和誘發女性乳腺癌等）[7]，因此口服溶液中防腐劑含量的控制就顯得非常必要。

預試驗中考察了乙腈-0.1%磷酸鹽溶液、甲醇-0.1%磷酸鹽溶液、乙腈-0.01 mol/L磷酸鹽溶液、甲醇-0.01 mol/L磷酸鹽等為流動相時的分離度，結果，以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含2.5 mmol/L庚烷磺酸鈉和0.1%三乙胺，用磷酸調節pH至2.5±0.1）為流動相進行梯度洗脫時的分離效果最佳，峰形較好。故選擇乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含2.5 mmol/L庚烷磺酸鈉和0.1%三乙胺，用磷酸調節pH至2.5±0.1）為流動相。

本試驗分別考察了柱溫為20、25、30、35、40 ℃時的分離效果，結果，當柱溫為20、25 ℃時，分離效果欠佳；當柱溫超過35 ℃時，磷酸可待因與鹽酸麻黃堿峰的分離效果下降。故選擇柱溫為30 ℃。

本試驗分別考察了不同品牌及不同型號的色譜柱[Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBrige C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、AkzoNobel Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、GL·Science WondaSil C18-WR（250 mm×4.6 mm，5 μm）]對分離度的影響，結果，當色譜柱為GL·Science WondaSil C18-WR（250 mm× 4.6 mm，5 μm）時的分離效果較好。故選擇GL·Science Wondasil C18-WR（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱。

綜上所述，本方法操作簡單，精密度、穩定性、重復性均較好，可用于同時測定復方磷酸可待因口服溶液中磷酸可待因、鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏、苯甲酸鈉和羥苯乙酯的含量。

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（收稿日期：2018-05-02 修回日期：2018-07-17）

（編輯：陳 宏）