竹蓀多糖對卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺功能及氣道炎癥的影響

【摘要】目的：研究竹蓀多糖對哮喘小鼠肺功能及氣道炎癥的影響。方法：將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為六組（n=10）：空白對照組、哮喘模型組（OVA）、地塞米松組（10mg/kg，陽性對照物）、竹蓀多糖低劑量組（100mg/kg）、竹蓀多糖中劑量組（200mg/kg）和竹蓀多糖高劑量組（400mg/kg）。測定小鼠呼吸系數(shù)阻力、呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性、支氣管肺泡灌洗液炎性細(xì)胞數(shù)量和肺組織相關(guān)炎癥因子水平。結(jié)果：與哮喘模型組比較，竹蓀多糖高劑量組呼吸系數(shù)阻力更低，呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性更高，支氣管肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)更低，P<0.05；與哮喘模型組比較，竹蓀多糖低劑量組、竹蓀多糖中劑量組和竹蓀多糖高劑量組小鼠BALF上清液中IL-4、IL-5和IL-13水平明顯更低（P<0.01），而IFN-γ水平明顯更高（P<0.05）。結(jié)論：竹蓀多糖可顯著改善哮喘小鼠肺功能和肺部炎癥，對哮喘小鼠具有明顯的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】竹蓀多糖；哮喘；肺功能；炎癥因子

基金項(xiàng)目：山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自由探索類）項(xiàng)目《基于TAK-779失活CCR5抑制P13K/AKT/mTOR通路影響支氣管上皮細(xì)胞自噬作用的研究》；山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目《樹突狀細(xì)胞CC趨化因子受體7的表達(dá)在煙霧暴露影響哮喘免疫炎癥機(jī)制中的作用研究》 （2014-重點(diǎn)8）

Effects of Dictyophora polysaccharide on lung function and airway inflammation in ovalbumin induced asthma mice

CAO Wen1， WEI Siang2， WANG Jialin3， ZHAO Jinpeng3

1. Department of Respiratory and Critical Care Medicine， Shanxi Provincial People’s Hospital， Taiyuan， Shanxi 030012， China； 2.Beijing Bioscience Biomedical Technology Co.， Ltd， Beijing 100000， China； 3.College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801， China

【Abstract】Objective：To study the effects of Dictyophora polysaccharide on lung function and airway inflammation in asthmatic mice.Methods：Sixty BALB/c mice were randomly divided into six groups （n=10）：The blank control group，the asthma model group（OVA），the dexamethasone group （10 mg/kg，positive control），the low dose Dictyophora polysaccharide group （100 mg/kg），the medium dose Dictyophora polysaccharide group （200 mg/kg） and the high dose Dictyophora polysaccharide group （400 mg/kg）.The respiratory coefficient resistance，respiratory system compliance，the number of inflammatory cells in Bronchoalveolar lavage fluid and the levels of lung tissue related inflammatory factors were measured in mice.Results：Compared with the asthma model group，the respiratory coefficient resistance in the high dose Dictyophora polysaccharide group was lower，the respiratory system compliance was higher，and the total number of inflammatory cells，macrophages count，eosinophils count，lymphocytes count and neutrophils count in bronchoalveolar lavage fluid were lower，P<0.05；Compared with the asthma model group，the levels of IL-4，IL-5 and IL-13 in mouse BALF supernatant in the low dose Dictyophora polysaccharide group，the medium dose Dictyophora polysaccharide group and the high dose Dictyophora polysaccharide group were significantly lower （P<0.01），while the levels of IFN-γ were significantly higher （P<0.05）.Conclusion：Dictyophora polysaccharide can significantly improve lung function and lung inflammation in asthmatic mice，and have an obvious protective effect on asthmatic mice.

【Key？Words】Dictyophora polysaccharide； Asthma； Lung function； Inflammatory factors

哮喘是一種慢性呼吸道疾病，其特征是氣道高反應(yīng)性、炎癥浸潤和粘液過度分泌[1]。白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13是2型輔助性T細(xì)胞（Th2）分泌的細(xì)胞因子，與氣道中的嗜酸性粒細(xì)胞增多，共同導(dǎo)致過敏性哮喘中的氣道高反應(yīng)[2]。竹蓀多糖是從竹蓀中提取的，具有抗炎[3]和抗腫瘤作用[4]。本研究通過以卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠為研究對象，探討竹蓀多糖對過敏性哮喘的治療作用，以期為治療哮喘提供新的理論依據(jù)及藥物。

1. 材料與方法

1.1 動物

從北京斯貝福生物科技有限公司訂購60只SPF級BALB/c小鼠（6周，20～25g）。動物被飼養(yǎng)在SPF級動物房中，12h/12h光/暗循環(huán)，相對濕度為40%～70%，平均溫度為25℃。所有實(shí)驗(yàn)按照ARRIVE指南進(jìn)行。該研究得到了山西省人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

OVA（麥克林公司），氫氧化鋁（sigma公司），竹蓀多糖（成都普思生物科技股份有限公司），地塞米松（廣東南國藥業(yè)有限公司），IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ ELISA試劑盒（上海梵態(tài)生物科技有限公司），瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液（sigma公司）等。

1.3 造模與分組

在第1d和第14d，通過腹腔注射OVA（20μg），將其與氫氧化鋁（2mg）混合，誘導(dǎo)小鼠哮喘模型。有六組小鼠，每組10只，即空白對照組（正常對照組）、哮喘模型組（OVA致敏組）、地塞米松組（10mg/kg）、竹蓀多糖低劑量組（100mg/ kg）、竹蓀多糖中劑量組（200mg/kg）和竹蓀多糖高劑量組（400mg/kg）[5]。

1.4 肺功能檢測

暴露支氣管，做T型切口插管，連接肺功能震蕩儀測定呼吸系數(shù)阻力和呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性。

1.5 肺泡灌洗液收集及BALF計(jì)數(shù)

離心支氣管肺泡BALF（4℃，1500rpm/min，7min），上清液保存在-20℃?zhèn)溆茫褂肊LISA檢測，細(xì)胞沉淀用于分類計(jì)數(shù)。使用瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液分類計(jì)數(shù)各組小鼠BALF細(xì)胞[嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）、淋巴細(xì)胞（Lym）、巨噬細(xì)胞（Mac）、中性粒細(xì)胞（Neu）]。

1.6 ELISA檢測BALF細(xì)胞氣道炎癥因子

使用上海梵態(tài)生物科技有限公司試劑盒（IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ）測定BALF細(xì)胞中的IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒說明書方法操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，進(jìn)行x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 結(jié)果

2.1 竹蓀多糖對小鼠呼吸功能的影響

如圖1A所示，與空白對照組相比，哮喘模型組呼吸系數(shù)阻力顯著更高（P<0.01）；與哮喘模型組比較，地塞米松組和竹蓀多糖高劑量組呼吸系數(shù)阻力顯著更低（P<0.05）。如圖1B所示，與空白對照組相比，哮喘模型組小鼠呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性顯著更低（P<0.01）；與哮喘模型組相比，地塞米松組和竹蓀多糖高劑量組小鼠呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性均顯著更高（P<0.05）。

2.2 竹蓀多糖對哮喘小鼠BALF中細(xì)胞的影響

與空白對照組相比，哮喘模型組小鼠BALF的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)以及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯更高（P<0.01）；與哮喘模型組相比，竹蓀多糖高劑量組小鼠BALF的細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)以及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 竹蓀多糖對哮喘小鼠氣道炎癥的影響

與空白對照組比較，哮喘模型組小鼠IL-4、IL-5和IL-13水平明顯更高，而IFN-γ水平明顯更低（P<0.01）；與哮喘模型組比較，竹蓀多糖低劑量組、竹蓀多糖中劑量組和竹蓀多糖高劑量組小鼠BALF上清液中IL-4、IL-5及IL-13水平明顯更低，而IFN-γ水平明顯更高（P<0.05）。見表2。

3討論

本研究結(jié)果表明，竹蓀多糖能夠顯著改善小鼠的呼吸功能（呼吸系數(shù)阻力和呼吸系統(tǒng)順應(yīng)性），并減少氣道炎癥細(xì)胞數(shù)量，降低細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平，提高IFN-γ表達(dá)水平。相較于地塞米松組，竹蓀多糖高劑量組在減少氣道炎癥上表現(xiàn)出更好的效果。

在本研究中，竹蓀多糖逆轉(zhuǎn)了肺臟炎癥的增加，這表現(xiàn)為支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞）的減少。OVA誘導(dǎo)的哮喘模型中，使用竹蓀多糖口服治療可減少肺阻力的進(jìn)行性增加并恢復(fù)肺順應(yīng)性，表明在呼吸力學(xué)方面具有功能益處。

哮喘是一種主要以Th2型細(xì)胞分泌因子增加為主的疾病，BALF血清中富含IL-4、IL-5和IL-13。本研究結(jié)果顯示，OVA刺激導(dǎo)致BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平顯著增加，而IFN-γ水平降低，通過口服竹蓀多糖恢復(fù)到基線水平，與灌胃地塞米松治療的水平相當(dāng)。IL-4和IL-13是過敏性炎癥中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的釋放導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白E，引起肌肉收縮和慢性炎癥，導(dǎo)致哮喘癥狀。IL-4和IL-13可觸發(fā)B細(xì)胞轉(zhuǎn)換和降低IFN-γ的產(chǎn)生，促進(jìn)杯狀細(xì)胞化生和粘液生成，并調(diào)節(jié)氣道平滑肌細(xì)胞功能和不受控制的持續(xù)性哮喘的發(fā)展[6]。此外，已知IL-4、IL-5和IL-13是許多效應(yīng)細(xì)胞的化學(xué)引誘劑或激活劑，并負(fù)責(zé)炎癥細(xì)胞的肺部積聚。研究發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖減弱了支氣管和血管周圍炎癥細(xì)胞的浸潤，這主要表現(xiàn)為BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少。總之，這些數(shù)據(jù)表明，竹蓀多糖可能通過調(diào)節(jié)2型免疫反應(yīng)對哮喘發(fā)揮治療益處。

綜上，竹蓀多糖可能具有潛在的治療哮喘的作用，可以作為一種潛在的藥物候選物。

參考文獻(xiàn)

[1] 李雪花，張彥全.孟魯司特聯(lián)合布地奈德治療小兒支氣管哮喘的療效及對肺功能、T淋巴細(xì)胞亞群、炎性因子的影響[J].臨床合理用藥，2024，17（23）：142-145.

[2] 王飛，季濤云，王亞軍，等.咳嗽變異性哮喘患兒血清總IgE、VEGF、IL-4、IL-5、IL-13及外周血EOS表達(dá)水平與臨床意義[J].臨床肺科雜志，2019，24（2）： 266-270.

[3] 王茂行，胡俊峰，李昌哲，等.竹蓀多糖對砷中毒大鼠肝臟IL-6和TNF-α水平的影響[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，47（2）：191-196.

[4] 廖文鎮(zhèn).竹蓀多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性及其功能化抗腫瘤藥物的研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2015.

[5] 王益.基于蛋白質(zhì)組學(xué)探究砷中毒大鼠肺損傷的作用機(jī)制及竹蓀多糖的干預(yù)效果[D].貴陽：貴州醫(yī)科大學(xué)，2023.

[6] 商艷，胡振林，李強(qiáng)，等.BCG-DNA對哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞IFN-γ和IL-4產(chǎn)生的作用[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004（7）：718-720.