HPLC法同時測定四粒紅花生衣藥材中原兒茶酸和兒茶素的含量

胡 洋，王 燕，馬曉靜，王丹彧△

(1.第964醫院第二門診部，吉林 長春 136002；2.四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000)

花生衣為豆科植物落花生AraehishypogaeaL.的成熟種子的種皮，應用于中成藥益血生膠囊(片)、復方紅衣補血口服液和血寧糖漿中。花生衣性平，味甘、微苦、澀，可養血止血，適宜貧血及各種出血性疾病。目前，由于花生衣無國家標準，落花生育種技術的更新，其新品種層出不窮，各省市對其藥材質控差異較大。花生作為吉林省四大經濟作物之一，其獨特的品種為四粒紅，在網絡平臺及社會上收到消費者的青睞。目前側重于花生衣藥材中化學成分及色素的研究報道較多，如：有報道從花生衣中分離出對羥基苯甲酸、原兒茶酸、原兒茶酸甲酯、兒茶素等化學成分[1-4]，而對四粒紅類花生衣的研究報答較少，本研究參考文獻[5-11]，建立了四粒紅類花生衣中原兒茶酸和兒茶素的液相色譜測定法，為吉林省特有品種四粒紅類花生深度開發應用提供基礎，為四粒紅類花生衣質控提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；BT125D型電子天平(賽多利斯公司)、 原兒茶酸(批號：110809-201906，含量：97.7%)、兒茶素(批號：110877-202005，含量：95.1%)均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈及甲醇為色譜純，水為超純水。藥材來源見表1，均為產地收集，由吉林農業大學包海鷹教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 采用Agilent TC-C18(4.6×250 mm，5 μm)為色譜柱，以乙腈-0.3%磷酸(10∶90)為流動相，流速1.0 mL·min-1，檢測波長270 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 混合對照品溶液 取原兒茶酸、兒茶素對照品各約10 mg，精密稱定，分別置20 mL量瓶中，加50%的甲醇稀釋至刻度，分別得到原兒茶酸、兒茶素對照品儲備液。精密量取原兒茶酸對照品儲備液1 mL，兒茶素對照品儲備液5 mL，置于同一50 mL量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含原兒茶酸10 μg，兒茶素50 μg的混合溶液，即得。

1.2.2.2 供試品溶液 取本品粉末(過三號篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.2.3 系統適用性試驗 分別取混合對照品溶液、樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果供試品色譜中，在與對照品色譜相同保留時間處檢出相同的色譜峰，且與其它組分能達到基線分離，分離度良好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

1.2.4 線性關系考察 分別精密取標準儲備適量，用50%甲醇稀釋制成每1 mL含原兒茶酸4.73 μg、9.46 μg、14.19 μg、18.92 μg、23.65 μg；含兒茶素27.08 μg、54.16 μg、81.24 μg、108.32 μg、135.40 μg的混合標準系列溶液。按照“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積(Y)為縱坐標，各對照品濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標，進行線性回歸，得原兒茶酸線性方程Y=26.353X+1.15，r=0.999；得兒茶素線性方程Y=5.0299X+1.81，r=0.999；結果表明原兒茶酸在4.73～23.65 μg·mL、兒茶素在27.08～135.40 μg·mL-1的范圍內線性關系良好。

1.2.5 重復性 取同一花生衣樣品(HSY-1)分別精密稱取6份，按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，結果原兒茶酸的含量為0.10 mg· g-1，RSD為0.9%；兒茶素的含量為0.74 mg· g-1RSD為0.8%，結果表明該方法重復性良好。

1.2.6 穩定性 取上述重復性試驗項下同一供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件下分別在0、2、4、6、8、16 h測定，記錄峰面積考察溶液穩定性，結果顯示原兒茶酸的RDS為1.4%，兒茶素的RSD為1.1%，表明該溶液穩定性良好。

1.2.7 回收率試驗 精密稱取已知含量的同一樣品(HSY-1)約2.0 g，共6份，按照1∶1的比例加入對照品溶液，按照2.2.2項下制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，結果原兒茶酸的回收率為97.93%，RSD=1.7%；兒茶素的回收率為96.65%，RSD=1.9%。

2 結果

2.1 樣品測定 取10批四粒紅花生衣藥材，按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進行測定，測定結果見表1。

表1 紅四粒樣品含量測定結果

3 討論

3.1 測定波長的選擇 本研究對原兒茶酸及兒茶素對照品和供試品溶液在200～400 nm的波長處進行掃描，原兒茶酸在260 nm處有最大吸收、兒茶素在278 nm處有最大吸收，同時樣品溶液與對照品溶液吸收光譜相同。綜合樣品中兩個主成分的含量、峰面積及其他物質的影響選擇在270 nm的波長處進行測定。

3.2 提取條件的篩選 本研究分別比較了不同濃度的甲醇、料液比、超聲時間，以原兒茶酸和兒茶素含量的和為考察指標，最終確定四粒紅類花生衣中原兒茶酸和兒茶素的最佳提取工藝為：樣品2 g加50%甲醇的25 mL超聲處理30 min，不僅操作簡便、方便，又能提取完全。

3.3 色譜條件的選擇 本研究分別比較了乙腈-水和乙腈-0.3%磷酸為流動相時的色譜行為，研究結果表明，使用乙腈-水為流動相時兒茶素色譜峰能達到較好的基線分離，但是原兒茶酸色譜峰與雜質峰分離效果較差，且原兒茶酸峰有拖尾現象，當改用乙腈-0.3%磷酸為流動相時，兩個色譜峰基線平穩且均能到達較好的分離，最終選擇乙腈-0.3%磷酸(10：90)為流動相。