濃縮蘋果汁中嗜酸耐熱菌的分離鑒定及菌群特性研究

摘 要：為了解和控制濃縮蘋果汁中的嗜酸耐熱菌，從脹袋濃縮蘋果汁中篩選、分離、純化得到了1株嗜酸耐熱菌，并進(jìn)行菌種鑒定及特性研究。通過(guò)菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和16S rDNA基因測(cè)序以及建立系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步確定該分離菌與Aiyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025標(biāo)準(zhǔn)菌同源度gt;99.51%，確定該分離菌為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（A. acidoterrestris）。通過(guò)熱和酸堿處理考察該菌株的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，在最優(yōu)滅菌參數(shù)為pH 6.0，105 ℃熱處理20 min的條件下，平板生長(zhǎng)菌落數(shù)為0，說(shuō)明該提取條件具有較好的合理性和可靠性，為濃縮蘋果汁中嗜酸耐熱菌的控制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：濃縮蘋果汁;篩選分離;嗜酸耐熱菌;分離鑒定;菌群特性

中圖分類號(hào)：TS255.44 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-1038（2024）03-0028-06

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.03.005

Isolation， Identification and the Bacteria Colony Characteristic"of Thermo-acidophilic Bacteria in the Apple Juice Concentrate

MENG Xiuqin1，2， DING Jianzi1，3， ZHANG Hui1， WANG Kun1， WU Maoyu4，"SHEN Wenbin1， ZHAO Yan4， CHU Le4

（1. Yantai North Andre Juice Co.， Ltd.， Yantai 264100， China; 2. Key Laboratory of Apple Deep Processing Technology of Shandong Province， Yantai 264100， China; 3. Fruit and Vegetable Storage and Processing Technology Innovation Center of Shandong Province， Yantai 264100， China; 4. Jinan Fruit Research Institute，"All China Federation of Supply amp; Marketing Cooperatives， Jinan 250014， China）

Abstract： In order to understand and control thermo-acidophilic bacteria in apple juice concentrate， a strain of thermo-acidophilic bacteria was screened， isolated， and purified from the apple juice concentrate in expansion bags. The thermo-acidophilic bacteria were identified by cell morphology， colony morphology， 16S rDNA test with phylogenetic tree analysis. The result showed that the homology of isolated strain and standard bacteria ATCC 49025 reached to 99.51%. The isolated strain was identified as Aiyclobacillus acidoterrestris. The thermal stability and acid-base stability of the strain were examined by heat and acid-base treatment. Orthogonal experiment was carried out on the base of single factor experiments， and it was found that the optimal sterilization parameter was to heat treat at 105 ℃ for 20 min at pH 6.0. Under this parameter， the number of colonies growing on the plate was 0. The result indicated that the extraction conditions have good rationality and reliability. The conclusion provided a theoretical basis for the control of thermo-acidophilic bacteria in apple juice concentrate.

Keywords： Apple juice concentrate; screening and isolation; thermo-acidophilic bacteria; separation and identification; microbial characteristics

濃縮蘋果汁是以蘋果為原料，經(jīng)物理方法去除一定比例的水分獲得的濃縮液，是果汁飲料和酸奶加工常用的原料[1-2]。濃縮蘋果汁是除橙汁以外世界需求量第二大的果汁，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含糖量高[2-3]。酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Aliyclobacillus acidoterrestris）是一種嗜酸、耐熱的菌，生長(zhǎng)pH范圍為2.0～6.0，生長(zhǎng)溫度為20～60 ℃，因此俗稱嗜酸耐熱菌、耐熱菌[4-7]。嗜酸耐熱菌在果汁加工過(guò)程中繁殖，以芽孢的形式耐受果汁加工過(guò)程中的巴氏殺菌，一旦遇到合適的萌發(fā)環(huán)境即大量繁殖代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚和鹵酚，導(dǎo)致果汁的口感風(fēng)味變差，濁度升高甚至在包裝物底部形成白色沉淀，是濃縮果汁生產(chǎn)控制中最重要的目標(biāo)控制微生物[8]。截止目前并未報(bào)道過(guò)因該菌而致病的案例，說(shuō)明其本身無(wú)毒性，對(duì)果汁和人體健康無(wú)影響[9-11]。但我國(guó)濃縮蘋果汁大部分出口國(guó)外，國(guó)際貿(mào)易中嚴(yán)格要求每10 mL果汁中耐熱菌含量小于1個(gè)，研究表明每10 mL中存在1個(gè)耐熱菌即可導(dǎo)致品質(zhì)劣變，美國(guó)及歐洲大部分國(guó)家要求果汁中不允許檢出耐熱菌[12-13]。果汁生產(chǎn)過(guò)程包括原料清洗、破碎、壓榨、預(yù)濃縮、酶解、超濾、樹脂純化、濃縮、巴氏殺菌、灌裝等步驟，前期溫度低，微生物繁殖不明顯，后期步驟溫度升高，有利于微生物的生長(zhǎng)[14-16]。不同的原料加工工藝、果汁的糖度和酸度等有所不同，因此嗜酸耐熱菌種類也不同，因此控制微生物污染一直是果汁加工面臨的難題[17]。

本試驗(yàn)擬對(duì)脹袋濃縮蘋果汁中耐熱微生物進(jìn)行分離及特性研究，以期更好地提高濃縮蘋果汁品質(zhì)，把控產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為蘋果濃縮汁加工、保藏和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮蘋果汁，pH值為3.5～4.5，可溶性固形物含量為70 Brix，-18 ℃保存，來(lái)自煙臺(tái)北方安德利果汁股份有限公司;蘋果酸，分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司;酵母提取物、葡萄糖、可溶性淀粉、瓊脂，分析純，均購(gòu)自默克化工技術(shù)（上海）有限公司;K氏瓊脂，分析純，海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002電子分析天平，METTLER TOLED公司;WB-2010A恒溫水浴鍋，天津奧特賽恩斯儀器有限公司;877酸度計(jì)，Metrohm公司;D-1-70高壓滅菌鍋，北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司;超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;恒溫振蕩水浴鍋，Selecta公司;Smart-1折光儀，ATAGO公司。

1.3 培養(yǎng)基制備

1.3.1 YSG培養(yǎng)基

A液：酵母提取物2 g，葡萄糖1 g，可溶性淀粉2 g，蒸餾水500 mL;用1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH至3.7，加熱至沸騰。B液：瓊脂15 g，蒸餾水500 mL，加熱至沸騰。將A液及B液分別在121 ℃高溫滅菌15 min，冷卻至50 ℃后將A液及B液混合后傾注平板。

1.3.2 K氏培養(yǎng)基

稱取12.3 g K氏瓊脂，加熱溶解于500 mL蒸餾水中，121 ℃高溫滅菌25 min。滅菌結(jié)束后加入10%過(guò)濾除菌的蘋果酸溶液10 mL，混勻，冷卻至50 ℃后傾注平板。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株分離純化

（1）菌株分離

抽取3份脹袋濃縮蘋果汁，分別用無(wú)菌水稀釋至11.5 Brix，取50 mL樣品在80 ℃水浴中加熱13 min[19]，然后放入冰水浴中迅速冷卻至45 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

將培養(yǎng)后的樣品進(jìn)行梯度稀釋[6]，吸取濃度為10-7、10-8梯度，取樣液200 μL涂布于YSG培養(yǎng)基平板上，45 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落培養(yǎng)情況。YSG培養(yǎng)基支持所有已知的脂環(huán)芽孢桿菌的生長(zhǎng)，從YSG培養(yǎng)基上選取單一菌落接種至K氏培養(yǎng)基上，45 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察是否有菌落產(chǎn)生。K氏培養(yǎng)基主要培養(yǎng)酸土脂環(huán)芽孢桿菌和部分酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。因此在K氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌基本確定為嗜酸耐熱菌。

（2）菌株純化

將篩選出來(lái)的嗜酸耐熱菌在K氏培養(yǎng)基平板上連續(xù)多次平板劃線純化，45 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，直至出現(xiàn)單菌落。挑取平板上的單菌落培養(yǎng)，得到純菌株，即分離菌A-1。

1.4.2 菌種鑒定

（1）菌落形態(tài)

將分離純化的嗜酸耐熱菌劃線接種到K氏培養(yǎng)基平板上，45 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察出現(xiàn)的單菌落形態(tài)特征。

（2）顯微形態(tài)

將分離純化的嗜酸耐熱菌進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

（3）16S rDNA分子鑒定

以提取菌株DNA為模板，以27F和1492R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃延伸2 min，最后在72 ℃下延伸10 min，凝膠回收目的片段后，4 ℃保存樣品。

本試驗(yàn)采用Sanger法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNA MAN軟件進(jìn)行拼接處理。

1.4.3 熱穩(wěn)定性單因素試驗(yàn)

（1）熱穩(wěn)定性處理溫度

菌株45 ℃液體培養(yǎng)即取0.1 mL純化好的嗜酸耐熱菌菌懸液（104 CFU/mL）接種到50 mL濃縮蘋果汁中。72 h后，80 ℃熱處理13 min。取適量稀釋液于85、90、95、100、105 ℃熱處理20 min。分別涂布于YSG培養(yǎng)基上，于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，觀察耐熱菌的生長(zhǎng)情況。

（2）熱處理時(shí)間

菌株45 ℃液體培養(yǎng)72 h后，80 ℃熱處理13 min。取適量稀釋液于100 ℃分別處理10、15、20、25、30 min。分別涂布于YSG培養(yǎng)基上，于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，觀察耐熱菌的生長(zhǎng)情況。

1.4.4 酸堿穩(wěn)定性單因素試驗(yàn)

菌株于45 ℃液體培養(yǎng)72 h后，80 ℃熱處理13 min，稀釋，分別接種于pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的YSG培養(yǎng)基（用蘋果酸調(diào)節(jié)）上，于45 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察耐熱菌生長(zhǎng)情況。

1.4.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以滅菌效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用熱處理溫度、熱處理時(shí)間、pH值進(jìn)行因素L9（34）正交試驗(yàn)[19-20]，試驗(yàn)方案如表1所示。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸耐熱菌的確定

2.1.1 分離純化

通過(guò)從脹袋濃縮蘋果清汁中分離純化，得到1株嗜酸耐熱菌，如圖1所示。該菌株經(jīng)80 ℃水浴13 min后在YSG培養(yǎng)基和K氏培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，即經(jīng)過(guò)熱處理和酸處理仍長(zhǎng)勢(shì)良好，說(shuō)明該菌株具有耐熱耐酸性。

2.1.2 菌落形態(tài)分析

圖1和圖2分別為嗜酸耐熱菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色顯微形態(tài)圖。由圖1中可以看出，菌落呈奶油狀，乳白色，表面反光，邊緣整齊，菌落平伏，不透明。圖2顯示菌體呈桿狀，為革蘭氏陽(yáng)性菌。圖3為芽孢染色圖，紅色為菌體，綠色為芽孢[21]，結(jié)果表明該菌株產(chǎn)芽孢，芽孢呈橢圓形。

2.1.3 分子生物學(xué)結(jié)果

測(cè)序結(jié)果采用DNA MAN軟件進(jìn)行拼接處理。拼接結(jié)果在GENEBANK上進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選同源性超過(guò)99%的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。

由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，該菌株與ATCC 49025標(biāo)準(zhǔn)菌同源度gt;99.51%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定該分離菌株為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）。

2.2 單因素試驗(yàn)

由表2、3可知，隨著處理溫度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株生長(zhǎng)逐漸受到影響。嗜酸耐熱菌具有較強(qiáng)的耐熱性，其耐熱性主要體現(xiàn)在芽孢上，在蘋果汁加工過(guò)程中，巴氏殺菌或高溫瞬時(shí)滅菌并不能使芽孢完全失活，待條件適宜時(shí)芽孢會(huì)在蘋果汁中萌發(fā)并最終導(dǎo)致蘋果汁腐敗、脹袋等現(xiàn)象。因此選擇處理溫度95～105 ℃，處理時(shí)間15～25 min作為正交試驗(yàn)范圍。

由表4可以看出，當(dāng)pH為3.0～4.0時(shí)，菌種長(zhǎng)勢(shì)最好，而當(dāng)pHgt;4后，菌種長(zhǎng)勢(shì)反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。pH 4.0為該菌種的最適生長(zhǎng)pH，由該最適pH可以看出該菌種表現(xiàn)對(duì)酸性條件的嗜好性，有較好的耐酸性，只有酸性條件才適宜其繁殖。因此選擇pH 4.0～6.0作為正交試驗(yàn)范圍。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

由表5、6可知，熱處理溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)有顯著影響、熱處理時(shí)間及pH值均對(duì)菌株生長(zhǎng)影響不顯著，影響程度依次為Agt;Cgt;B，即處理溫度gt;pH值gt;處理時(shí)間。通過(guò)正交試驗(yàn)得到的理論最優(yōu)組合為A3B2C3，即熱處理溫度105 ℃、熱處理時(shí)間20 min、pH值為6.0時(shí)可以最大程度地減少蘋果汁中的菌落數(shù)。以最佳條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，平板生長(zhǎng)菌落數(shù)均為0，說(shuō)明該提取條件具有較好的合理性和可靠性。

3 結(jié)論

從脹袋濃縮蘋果汁中分離純化獲得一株嗜酸耐熱菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和16S rDNA初步鑒定，該菌株與ATCC 49025標(biāo)準(zhǔn)菌同源度gt;99.51%，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，最終確定該分離菌株為酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌。通過(guò)單因素試驗(yàn)探究了熱處理溫度、處理時(shí)間、pH值對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，熱處理溫度對(duì)其菌落生長(zhǎng)影響顯著，熱處理時(shí)間及pH值均對(duì)其菌落生長(zhǎng)影響不顯著。最終得到的耐熱菌最佳滅菌參數(shù)為pH值6.0時(shí)，105 ℃處理20 min。在此滅菌參數(shù)下，可使該菌株失活，具有省時(shí)、高效、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，以期為濃縮蘋果汁加工提供新的工藝方案。

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基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（重大科技創(chuàng)新工程）（2022CXGC010601）

第一作者簡(jiǎn)介：孟秀芹（1976—），女，高級(jí)工程師，本科，主要從事食品加工技術(shù)研究工作