蘋果6-磷酸葡萄糖酸內酯酶基因MdPGLA的克隆及功能分析

摘要：6-磷酸葡萄糖酸內酯酶（PGL）是氧化戊糖一磷酸途徑的關鍵酶，在糖代謝以及植物免疫反應中發揮著重要作用。本研究基于前期轉錄組測序結果篩選出對輪紋病有強烈響應的基因MD01 G1226300，并對該基因進行克隆鑒定與功能分析。結果表明，接種輪紋病菌6d后，‘魯麗’蘋果的病斑面積顯著小于其親本‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號’；qRT-PCR分析發現MD01 G1226300被強烈誘導表達，但在‘魯麗’中的表達水平顯著低于‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號’。生物信息學分析結果表明，MD01 G1226300的cDNA全長762 bp，編碼253個氨基酸，MDOIG1226300蛋白相財分子量為28.04 kDa，理論等電點為5.85，為穩定的親水性蛋白，屬于SugarP_isomerase超家族，存在6個可能的活性位點，無跨膜結構域且整體位于膜外區，三級結構主要由α螺旋和B折疊形成：通過同源序列比對分析后命名為MdPCLA，與梨PbPGL4進化關系最近，氨基酸序列同源性為70. 13%。超表達MdPGIA的轉基因蘋果愈傷組織對輪紋病的抗性以及抗性相關基因的表達水平顯著低于對照，表明MdPGIA負調控蘋果對輪紋病的抗性。本研究結果豐富了蘋果中PGL家族基因響應生物脅迫的理論體系，為蘋果抗病分子機制解析和通過遺傳性狀改良創制抗病蘋果新種質提供了參考基因。

關鍵詞：蘋果：MdPGIA；輪紋病：基因克隆：功能驗證

中圖分類號：S661.1：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0016-07

蘋果（Malus domestica Borkh.）是溫帶地區種植面積最大、經濟價值最高的水果之一，但其產量和品質常受病蟲害影響，嚴重制約蘋果產業的健康發展。由葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起的蘋果輪紋病（apple ring rot）又稱粗皮病，易造成果實腐爛，引起樹勢衰弱或整株死亡，是我國蘋果主產區最嚴重的病害之一。在生產上，果農為控制病害多采取噴施農藥等化學方法，易導致輪紋病菌抗藥性提高，且造成嚴重環境污染。因此，探索防治輪紋病新策略、選育抗輪紋病新品種是蘋果遺傳育種亟待解決的重要問題，對推動我國蘋果產業高質量發展具有重要意義。

磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是細胞中重要的初生代謝途徑，是碳源合成植保素、木質素等次生代謝途徑的必經中間途徑，具有重要的生理功能，可為核苷酸合成和芳香氨基酸產生提供還原劑NADPH、5-磷酸核酮糖以及4-磷酸赤蘚糖。PPP途徑可分為兩個階段：氧化階段和非氧化階段。氧化PPP（oxidativePPP，OPPP）將6-磷酸葡萄糖轉化為5-磷酸核酮糖，后者成為非氧化PPP的底物。OPPP是細胞代謝的一個中心分支，為生物合成代謝提供NADPH和磷酸糖。在植物細胞中，OPPP分支存在于細胞質和質體中，由6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）、6-磷酸葡萄糖酸內酯酶（6PGL）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGD）組成。在擬南芥中，這些酶由核基因組中的小基因家族編碼，包括6個G6PD、5個6PGL和3個6PGD亞型。擬南芥PGL1、PGL2、PGIA和PGL5四個基因編碼了6-PGL的細胞質亞型，這些基因可能在細胞質中具有冗余作用。PGL3包含一個N端延伸和一個C端過氧化物酶體靶向基序（PTSI），同時具有質體和過氧化物酶體靶向信號。PGL與植物的生長發育和逆境脅迫反應密切相關。在強抗寒的冬小麥品種Dn1中，Ta6PGL與小麥的抗寒性相關，低溫條件下該基因的表達量上升，通過介導PPP途徑顯著提高植株的抗寒性，在擬南芥中，所有組織中的PGL3表達一致，發育種子中的表達略有升高，并且該基因的轉錄在整個發育過程中相對較高且穩定。PGL3的表達水平與植物應對生物和非生物脅迫相關。擬南芥pgl3-1突變體表現為植株矮小，抗性相關基因表達水平顯著提高，抗病性增強。

本研究基于前期蘋果接種輪紋病菌后的表型及轉錄組測序結果，篩選出對輪紋病有強烈響應的基因MDOIG1226300，該基因與擬南芥AtPGL3同源性較高。為進一步解析基因功能，本研究從接種輪紋病菌后的蘋果果實中克隆得到MDOIG1226300，并進行生物信息學分析，隨后通過蘋果愈傷組織同源轉化驗證其在蘋果對輪紋病抗性中的功能，以期為蘋果抗病性遺傳改良提供重要的參考基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蘋果品種為‘魯麗’、‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號’。所有試材定植于山東省果樹研究所天平湖基地（36°13＇N，117°01＇E）。連續3年對上述試材進行抗病性調查及鑒定，取樣前15 d不噴施農藥，其他按常規管理進行。遺傳轉化所需‘王林’蘋果愈傷組織于MS培養基中在24℃黑暗條件下培養。室內人工接種所用菌株為山東省果樹研究所果樹病蟲害監測與防控創新團隊自‘富士’蘋果果實中分離出的輪紋病菌葡萄座腔菌（Botryospheria dothidea）.

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果果實病菌接種

取28℃培養箱中菌絲生長旺盛且一致的輪紋病菌，蘋果果實用滅菌后的牙簽扎深5 rum的小孔，塞滿菌絲，培養6d后取樣，樣品液氮速凍后-80℃保存備用。

1.2.2 不同品種蘋果果實中MDOIG1226300的表達分析

本研究設計qRT-MDOIG1226300-F/R引物（表1），使用BIO-RAD實時熒光定量PCR儀和FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（Roche，USA）進行qRT-PCR，分析MDOIG1226300在接種及未接種輪紋病菌的‘魯麗“皇家嘎啦’‘藤牧1號’蘋果果實中的表達模式。以蘋果Mdactin為內參基因。每處理6個樣品，3次重復。采用2-AAC‘法計算基因表達水平。

1.2.3 MDOIG1226300的克隆與載體構建

用RNA Prep Pure Plant Kit試劑盒（TIANGEN，北京）提取蘋果果實的總RNA，在蘋果GDDH13_1—1數據庫下載MDOIG1226300的全長序列，設計特異性引物（表1）。采用反轉錄試劑盒（RevertAidTMFirst-Strand cDNA synthesis Kit， Thermo， USA）合成cDNA第一鏈，并以cDNA為模板進行擴增。用Gel Extraction Kit快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（CWBio，北京）對得到的特異性PCR產物進行回收，并連接至T載體（TIANGEN，北京），采用熱激法轉化大腸桿菌DH5cc感受態細胞。選取PCR驗證正確的陽性單克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。在NCBI網站（www.nlm.nih.gov）上對測序結果進行比對。

1.2.4 MdPGLA的生物信息學分析

通過Expasy網站（https：//web．expasy．org/compute_pi）在線分析MDOIG1226300蛋白理化性質。利用NCBI網站分析軟件對MDOIG1226300蛋白進行保守結構域分析。采用DNAMAN 8.0（Lynnon Biosoft，USA）、DNA Club數據分析軟件對多個物種的同源蛋白進行序列比對分析。利用MEGA 11.0軟件，選用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對多個物種的PGIA同源氨基酸序列構建系統進化樹。

1.2.5 農桿菌介導的蘋果愈傷組織轉化及轉基因株系表型觀察

將MdPGL4的CDS全長序列連接到超表達載體pBI121上，構建植物基因超表達載體pBI121 -MdPGIA-FLAG，利用LBA4404農桿菌介導的遺傳轉化法轉入蘋果‘王林’愈傷組織中，使用50mg/L卡那霉素篩選陽性植株，設計特異性引物并進行qRT-PCR鑒定，獲得超表達MdPGIA的蘋果愈傷組織。取28℃培養條件下菌絲生長一致的輪紋病菌，用打孔器取大小一致的菌餅接種于生長10 d的愈傷組織中央，黑暗培養4d后取樣，樣品液氮速凍后-80℃冰箱保存備用，通過qRT-PCR分析不同愈傷組織中抗性相關基因（表1）的表達模式。

2 結果與分析

2.1 ‘魯麗’對輪紋病的抗性分析及相關基因篩選

2.1.1 蘋果果實接種輪紋病菌后的表型分析

對‘魯麗’及其親本‘皇家嘎啦’‘藤牧1號’進行輪紋病菌接種，結果（圖1A、B）表明，接種6d后，‘魯麗’的病斑面積顯著小于‘皇家嘎啦’‘藤牧1號’，病斑直徑較兩者分別減小57%和30%。說明‘魯麗’對輪紋病具有較高的抗性。

2.1.2 MDOIG1226300基因的鑒定及表達模式分析

前期轉錄組測序分析發現MDOIG1226300基因的表達趨勢與蘋果對輪紋病的抗性呈顯著負相關。本研究利用qRT - PCR技術檢測MDOIG1226300在接種及未接種輪紋病菌的‘魯麗’‘皇家嘎啦’‘藤牧1號’果實中的表達模式，以未接種輪紋病菌的‘藤牧1號’為參比計算相對表達量。結果（圖1C）表明，接種輪紋病菌后MDOIG1226300在‘魯麗’‘皇家嘎啦’‘藤牧1號’中均被強烈誘導表達，品種間差異顯著；在‘魯麗’中的表達水平顯著低于‘皇家嘎啦’和‘藤牧1號’，表達量僅分別為兩者的37%和32%。以上結果進一步驗證了MDOIG1226300與蘋果對輪紋病的抗性呈負相關。

2.2 MDOIG1226300的克隆與生物信息學分析

以接種輪紋病菌后的蘋果果實cDNA為模板，通過PCR擴增得到750 bp左右的條帶（圖2A）；產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收后與pMD19-T Vector連接，轉化到DH5a感受態細胞，挑選陽性克隆后搖菌測序，結果目的基因cD-NA全長762 bp，編碼253個氨基酸，與蘋果基因組GDDH13數據庫中的MDOIG1226300一致，與擬南芥AtPGL3同源性較高。

MDOIG1226300蛋白的相對分子質量為28.04 kDa，理論等電點（pl）為5.85，包含28個Ala（11. 1%）、26個Leu （10.3%）、21個Lys （8.3%） ，21個Val（8.3%）；負電荷殘基（Asp+Glu）總數為33個，正電荷殘基（Arg+Lys）總數為27個；總平均親水系數（GRAVY）為-0.159，屬于親水性蛋白；脂肪系數為89.09，不穩定系數為26.56（＜40），為穩定蛋白。

蛋白保守結構域分析發現MDOIG1226300蛋白屬于SugarP-isomerase超家族蛋白，E值為2.09e-107。推測存在6個可能的活性位點，分別位于第45 - 50、75 - 80、155 - 160、185 - 190、210 - 215位氨基酸之間，與其在磷酸戊糖途徑中發揮的作用有關。通過TMHMM2.0預測MD01G1226300蛋白的跨膜區域，結果（圖2B）顯示，該蛋白在跨膜區和膜內區的概率極低，在膜外區的概率接近于1，說明其無跨膜結構域且整體位于膜外區。通過SWISS-MODEL對MD01G1226300三級結構進行預測，采用的模板為AOA540M7QI，序列相似度為88.93%，結果（圖2C）顯示，α螺旋和β折疊結構主要參與了MDOIG1226300蛋白三級結構的形成。

多序列比對結果（圖3）顯示，MD01G1226300與白梨（Pyrus bretschneideri Rehd）PbPCIA（XP_048427164.1）的同源性最高，為70.13%；與石榴（Punica granatum L.）PgPGIA（XP_031380672.1）、桃（Prunus persica）PpPGIA（XP_007218710.2）、甜橙（Citrus sinesis）CsPGIA（XP_006493166.2）的同源性分別為69.65%、66. 04%、56.35%，表明從蘋果中克隆得到的MDOIG1226300基因所編碼的蛋白與其他物種的PGIA蛋白具有較高的相似性，因此將該基因命名為MdPGL4。

為了進一步研究MdPGIA與其他物種的親緣關系，利用MEGA 11.0軟件基于氨基酸序列構建系統進化樹。結果（圖4）顯示，MdPGIA和Pb-PGIA聚在1個分支，親緣關系最近。

2.3 超表達MdPGIA的蘋果愈傷組織表型及抗性相關基因表達分析

為深入研究MdPGL4的功能，本研究通過LBA4404農桿菌介導的遺傳轉化方法進行蘋果愈傷組織轉化試驗，并進行qRT-PCR驗證，獲得了超表達MdPGL4的蘋果愈傷組織株系。隨后對超表達MdPGIA的愈傷組織1#和2#株系進行輪紋病菌接種試驗。如圖5A所示，接種輪紋病菌4d后，超表達MdPCL4的轉基因愈傷組織的病斑面積顯著大于對照，1#和2#株系病斑的平均直徑分別約為對照的2.1倍和1.9倍。表明MdPGIA的過量表達使轉基因蘋果愈傷組織對輪紋病菌的抗性降低。

對超表達MdPGLA轉基因愈傷組織中水楊酸（salicylic acid，SA）和氧化還原相關基因的表達水平進行分析，結果（圖5B）顯示，接種輪紋病菌4d后，SA相關基因MdNPR1、MdPAL以及氧化還原相關基因MdPOD、MdSOD在1#株系的表達水平均顯著低于對照：除MdNPR1外，在2#株系中的表達水平也顯著降低。

綜合以上研究結果推測，MdPGL4可能通過影響SA及氧化還原反應調控蘋果對輪紋病的抗性。

3 討論與結論

PPP是植物中心代謝途徑，與植物的生長發育密切相關。該途徑的不可逆氧化部分是NADPH的主要來源，以防止氧化應激：可逆非氧化部分是合成核苷酸、芳香氨基酸、苯基丙烷及其衍生物的碳骨架的來源。PPP包含一系列由7種不同酶催化的反應：G6PD、6PGL、6PGD、5-磷酸核糖異構酶（RPI）、5-磷酸核酮糖異構酶（RPE）、轉酮醇酶（TK）和轉醛縮酶（TA）。PGL是OPPP的主要酶類，可將6-磷酸葡萄糖-8-內酯加速水解為6-磷酸葡萄糖酸，為生物合成反應提供重要的還原劑等物質，AtPGL3是唯一編碼具有N端轉運肽和保守PTSI的PGL基因，為擬南芥生長發育所必需。本研究在接種輪紋病菌的蘋果果實中克隆得到擬南芥At-PGL3的同源基因MdPGIA，序列比對結果顯示MdPGIA與白梨PbPGIA氨基酸序列的同源性達70. 13%，屬于SugarP_isomerase超家族蛋白，存在6個可能的活性位點。

前人研究表明PGL在植物生長發育過程中表達量相對較高且穩定，并且在響應生物和非生物脅迫中具有重要作用。植物幼苗受低溫馴化時，PPP效率提高，從而增強抗凍性。擬南芥PGL3可提高OPPP效率，防止6-磷酸葡萄糖酸內酯的積累，以保證細胞內源化合物的完整性。AtPGL3通過改變植物葉片組織中的氧化還原狀態影響光合細胞的氧化還原平衡，從而激活防御反應。小麥PGL對分蘗節抗寒有著重要作用，-25℃條件下，PGL的表達水平顯著提高，導致PPP中Ru5P和NADPH等中間產物的積累，從而為植物的生物合成提供原料和專一性供體。此外，PPP的代謝終產物6-磷酸葡萄糖的累積也能增強細胞滲透壓，從而降低寒冷對細胞的傷害，擬南芥pgl3-1突變體表現為植株矮小，G6PD活性增強，細胞氧化還原電位降低，對丁香假單胞菌的抗性顯著提高。

目前，對于PGL基因的研究主要集中于模式植物，在蘋果中尚未有鑒定其功能的報道。本研究qRT-PCR分析結果表明，接種輪紋病菌后，不同品種的蘋果果實中MdPGL4的表達量顯著升高。對輪紋病敏感性越高的蘋果品種，MdPGIA的表達水平越高，推測MdPGIA與蘋果對輪紋病的抗性呈負相關。前期的研究表明，植物激素水楊酸水平和氧化還原反應與蘋果對輪紋病的抗性密切相關。與野生型相比，超表達MdPGL4的轉基因蘋果愈傷組織對輪紋病的抗性以及水楊酸和氧化還原抗性相關基因的表達水平顯著降低，表明MdPCLA負調控蘋果對輪紋病的抗性。

本研究通過對MdPGIA的克隆及其響應輪紋病的表達分析，豐富了蘋果屬植物PGL家族基因響應生物脅迫的理論體系，也為蘋果抗病分子機制解析和通過遺傳性狀改良創制抗病蘋果新種質提供參考基因。

基金項目：山東省自然科學基金青年項目（ZR2020QC147）；國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-27）；山東省重點研發計劃 （農業良種工程）項目（2023LZGCQY009）；山東省果樹研究所科研創新基金青年工程項目（2023GSKY02）；山東省重點研發計劃（重大科技創新工程）項目（2022LZGC010）