小麥大、小粒材料的細(xì)胞學(xué)鑒定及其粒重相關(guān)基因表達(dá)研究

摘要：籽粒大小是影響小麥產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀，開展控制籽粒大小相關(guān)基因的篩選鑒定和表達(dá)研究對小麥高產(chǎn)育種具有借鑒意義。本研究利用染色體計數(shù)和熒光原位雜交（FISH）的方法對15份大粒材料（千粒重高于50 g）和15份小粒材料（千粒重低于21 g）進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，京5044、京5085、藏1783、黑72-0484、uis鑒010共5份大粒材料的染色體條數(shù)為28，為四倍體小麥：其余材料染色體條數(shù)均為42，為六倍體小麥。選取六倍體的大粒和小粒材料各3份作為試驗材料，用水稻和擬南芥的64個粒重相關(guān)基因在小麥基因組中篩選同源基因，對其進(jìn)行qRT-PCR分析，選出6個在大、小粒材料中表達(dá)量存在顯著差異的基因進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明，基因RiGSK2、RiGW8和RiGGC2在大粒材料HR2015-1-1- 2-9中表達(dá)量較高，RiGS3和RiD11在小粒材料紅禿頭3中表達(dá)量較高，ArTTG2在3份小粒材料中表達(dá)量均較高，推測這6個基因可能是控制小麥粒重的關(guān)鍵基因，在后續(xù)研究中將進(jìn)一步驗證它們對小麥產(chǎn)量的貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞：小麥：籽粒大小：熒光原位雜交（FISH）：粒重相關(guān)基因：表達(dá)分析

中圖分類號：S512.1：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0010-07

種子大小是植物最重要的產(chǎn)量性狀之一，因此，開展控制籽粒大小的基因的相關(guān)研究，對培育高產(chǎn)小麥具有重要意義。目前已從小麥中鑒定出一些籽粒大小相關(guān)基因，主要包括負(fù)調(diào)控粒寬和千粒重的TaGW2基因及其同源基因，負(fù)調(diào)控種子大小的泛素激活蛋白酶基因TaDA1，編碼具有重復(fù)類似Kelch - like結(jié)構(gòu)的磷酸激酶基因TaGL3，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞分裂素氧化酶基因TaCKX，參與淀粉合成的關(guān)鍵基因TaACP-S1，控制粒寬和粒長的小麥蔗糖合成酶基因TaSUS1，正調(diào)控籽粒大小和重量的編碼絲氨酸羧肽酶的基因TaGS5，與粒重、粒寬、粒長相關(guān)的谷氨酰胺合成酶基因TaGS1，以及其他一些參與小麥籽粒大小形成的基因如TaC-YP78A3、TaGS3等。然而小麥基因組復(fù)雜龐大，仍存在大量重要的控制大小籽粒形成的基因未被挖掘出來，因此，繼續(xù)深入挖掘籽粒大小與重量相關(guān)基因?qū)τ谛←溒贩N改良意義重大。

目前控制種子大小的信號途徑在擬南芥和水稻中研究較多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了如泛素—蛋白酶體途徑、G蛋白信號途徑、絲裂原活化蛋白激酶信號途徑、植物激素和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子途徑等多種相關(guān)信號途徑。研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶信號途徑中，擬南芥MKK4/5在MAPK6的上游控制胚形成：轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子途徑中，擬南芥TTG2編碼一個WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致ttg2突變體被皮中的細(xì)胞長度減小：泛素一蛋白酶體途徑中，水稻GW2編碼一個環(huán)型E3泛素連接酶，通過加速籽粒灌漿，增加粒寬、粒重和產(chǎn)量；G蛋白信號途徑中，水稻RGB1 -DEP1/GGC2二聚體和分離的RGA1可能通過促進(jìn)穗殼中的細(xì)胞增殖激活未知的下游效應(yīng)因子來調(diào)節(jié)籽粒的大小。但以上基因是否參與控制小麥大小粒發(fā)育的信號通路仍不清楚。

本研究以15份大粒和15份小粒小麥材料為基礎(chǔ)，通過染色體計數(shù)和FISH核型分析選出含42條染色體、千粒重最高的3份大粒材料和最低的3份小粒材料，利用64個控制水稻和擬南芥大小籽粒發(fā)育的基因，通過同源比對的方法從小麥基因組中鑒定出同源基因，并用qRT-PCR法分析其在6份大、小粒材料中的表達(dá)差異，篩選出控制小麥籽粒大小的重要基因，為后續(xù)驗證這些基因?qū)π←湲a(chǎn)量的貢獻(xiàn)并用于品種改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

千粒重超過50 9的15份大粒小麥材料：DA-LI-1、DALI-2、京5044、京5085、藏1783、黑72-0484由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所（以下簡稱作物所）張榮志副研究員提供；DASUIDALI、LJ15鑒010和章丘大穗由作物所劉建軍研究員提供：HR2015-1-1-2-9、咸陽超大穗101、咸陽超大穗362、咸陽超大穗901、咸陽超大穗965由作物所韓冉博士提供：大穎殼由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)甯順宗教授提供。

千粒重低于21 9的15份小粒材料：紅禿頭3、紅穗、白穗白、小白麥、小白穗、腰珠紅、蘆麥、改麥、亮麥、小禿頭、紅芒麥、紅半芒、紅禿頭1、齊頭子和紅禿頭2為地方品種，由作物所樊慶琦研究員提供。

1.2 植物材料培養(yǎng)及樣品處理

將30份供試小麥材料的種子放于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于22-24℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。待種子萌發(fā)后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)到4℃冰箱處理24 h。將處理過的種子轉(zhuǎn)入22 - 24℃恒溫光照箱中培養(yǎng)24-35 h，待根尖長至1.0-1.5 cm時采集根尖，用冰水混合物處理24 h后用卡諾固定液I（無水乙醇：冰醋酸=3：1）固定3-7 d，放人4℃冰箱備用。

將篩選出的3份大粒材料HR2015-I-I-2-9、大穎殼、咸陽超大穗101和3份小粒品種白穗白、紅穗和紅禿頭3的種子種在10 cm×10 cm的花盆中，每個品種種5盆，每盆6株，在光照培養(yǎng)室培養(yǎng)（24℃，濕度60％，14 h光照/10 h黑暗）；孕穗期取幼嫩小穗，液氮處理后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ糠莶牧线x3株長勢一致的單株作為3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 千粒重的調(diào)查統(tǒng)計

2021年9月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田（36°2＇N，117°5＇E）種植15份大粒材料和15份小粒材料，2022年6月成熟期采收并調(diào)查千粒重。

1.4 染色體計數(shù)與FISH核型分析

將備用根尖的分生組織切下，放人含2%果膠酶R-IO（日本Yakult公司）和2％纖維素酶Y-23（日本Yakult公司）的10 μL混合酶液中，37℃水浴50 min酶解；酶解后，用70%乙醇沖洗2次，然后用解剖針搗碎，2 000 r·min-1離心10 s，倒掉乙醇，加入100％乙酸20 μL，渦旋混勻；取7μL根尖分生組織細(xì)胞懸浮液，滴到載玻片上，停留約5 min待乙酸完全揮發(fā)后鏡檢，鏡檢合格的染色體制片置于-20℃冰柜中備用。

取濃度約為10μmol·L-1的雙色FISH探針（Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1）各0.2 μL加入到8 μL 2x檸檬酸鈉（SSC）溶液（pH=7）中，渦旋混勻配成雜交液。將雜交液滴至上述制備好的玻片上，蓋上蓋玻片，置于濕潤的塑料盒中80℃變性5 min，然后將塑料盒置于37℃雜交箱中雜交Sh。取出染色體制片，放于裝有2xSSC溶液的洗脫缸中，洗掉蓋玻片和雜交液，然后再用ddH，O沖洗一遍，晾干，避光滴加一滴抗褪色劑，蓋上蓋玻片，用OLYMPUS BX53熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）鏡檢，DP70CCD鏡頭下拍照。

1.5 RNA提取及qRT-PCR分析

將采集的3份大粒材料和3份小粒材料的幼嫩小穗分別利用miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒（天根，北京）提取RNA，利用Nanodrop 2000/2000C分光光度計（Thermo，美國）測定RNA濃度。用PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser（TaKaRa，大連）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于qRT-PCR分析。

選取已報道的34個控制水稻籽粒大小發(fā)育和30個控制擬南芥籽粒大小發(fā)育的基因，在NC-BI網(wǎng)站（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov）搜索相應(yīng)的小麥同源基因，根據(jù)其保守序列區(qū)段，通過Primer3Plus軟件設(shè)計qRT-PCR引物，對其在3份大粒材料和3份小粒材料幼嫩小穗中的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR測定，發(fā)現(xiàn)有6個基因的表達(dá)量在大粒和小粒材料間存在顯著差異，對這6個基因在大、小粒材料中的表達(dá)情況進(jìn)行對比分析。這6個基因的引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：SYBR@ Green PCR Master Mix 10μL，稀釋的cDNA 2 μL，0.1 μmol·L-1正、反向引物各0.4 μL，用RNase free water補齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10s，60℃延伸30 s，40個循環(huán)。設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，用2-△△Ct法計算基因相對表達(dá)量。利用SPSSStatistics 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥材料的細(xì)胞學(xué)鑒定

利用染色體計數(shù)和FISH法對15份大粒材料和15份小粒材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，結(jié)果（表2）顯示，京5044、京5085、藏1783、黑72-0484、LJ15鑒010共5份大粒材料的染色體為28條，是四倍體小麥：其余大粒材料及所有小粒材料的染色體均為42條，是六倍體小麥。FISH鑒定結(jié)果以四倍體小麥黑72-0484和六倍體小麥HR2015 -1-1-2-9為例展示，見圖1。

2.2 用于分析粒重相關(guān)基因表達(dá)的小麥材料篩選

2022年6月收獲供試小麥材料，統(tǒng)計千粒重，結(jié)果見表2，大粒材料的千粒重在50.2 - 86.7 9范圍內(nèi)，小粒材料的千粒重在16.9 - 20.8 9范圍內(nèi)。從染色體條數(shù)為42的材料中，選千粒重高的前3位大粒材料以及千粒重低的前3位小粒材料，分別為HR2015-1-1-2-9、大穎殼和咸陽超大穗101以及白穗白、紅穗和紅禿頭3，用于后續(xù)粒重相關(guān)基因分析。

2.3 粒重相關(guān)基因在小麥大、小粒材料中的表達(dá)分析

利用64個控制水稻和擬南芥大小籽粒發(fā)育的基因，通過同源比對的方法從小麥基因組中找出同源基因，對其在3份大粒材料和3份小粒材料中的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR分析，其中有6個基因在大、小粒材料中的表達(dá)有顯著性差異，如圖2顯示。RiGSK2和RiGW8均在HR2015 -1-1-2-9中的表達(dá)量最高，且均顯著高于其他材料，分別為大粒材料大穎殼、咸陽超大穗101的3.0、1.9倍和1.6、1.6倍，分別為小粒材料紅禿頭3、紅穗、白穗白的8.1，3.6、2.2倍和2.3、1.8、1.3倍；RiG-GC2也是在HR2015-1-1-2-9中的表達(dá)量最高，顯著高于在紅禿頭3和紅穗中的表達(dá)量，約是兩者的2.9倍和1.3倍，但與其他材料差異不顯著。上述3個基因均在紅禿頭3中的表達(dá)量最低，在紅穗中的表達(dá)量較低。RiGS3在紅禿頭3中的表達(dá)量最高，顯著高于其他材料，約是小粒材料紅穗和白穗白的2.0倍和5.6倍，依次是大粒材料HR2015-1-1-2-9、大穎殼、咸陽超大穗101的3.4、3.0、4.8倍；其在白穗白和咸陽超大穗101中的表達(dá)量顯著低于其他材料。ArTTG2、RiD11在小粒材料中的表達(dá)量高于大粒材料，且ArTTG2在3份小粒材料中均達(dá)到差異顯著水平，而RiD11僅在紅禿頭3中達(dá)到差異顯著水平：ArTTG2在紅穗中的表達(dá)量最高，分別是紅禿頭3和白穗白的1.2倍和1.7倍，依次是大粒材料HR2015 -1-1-2-9、大穎殼、咸陽超大穗101的3.1、3.1、14.0倍；RiD11則是在紅禿頭3中表達(dá)量最高，分別是紅穗和白穗白的2.0倍和2.7倍，依次是大粒材料HR2015-1- 1- 2-9、大穎殼、咸陽超大穗101的3.3、3.7、2.8倍。

3 討論與結(jié)論

3.1 控制籽粒大小的小麥同源基因在大粒材料中的作用

小麥產(chǎn)量由單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重三要素決定，其中千粒重是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。挖掘小麥籽粒大小關(guān)鍵基因?qū)τ谔岣吡Ｖ剡M(jìn)而提高產(chǎn)量意義重大。如：Su等根據(jù)水稻中OsGV2基因調(diào)控粒重，同源克隆了小麥中與粒重相關(guān)的基因TaGW2。Ma等克隆了TaGS5 -3A基因，發(fā)現(xiàn)TaGS5-3A -T比TaGS5-3A -G基因型有更高的酶活：過表達(dá)該基因后，小麥籽粒增大，千粒重提高。Li等發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CKX2導(dǎo)致擬南芥iku2種子增大。可見，挖掘并過表達(dá)控制大粒發(fā)育的基因可提高小麥產(chǎn)量。

本研究利用水稻和擬南芥中調(diào)控籽粒發(fā)育的基因進(jìn)行同源比對，篩選到6個小麥同源基因，通過其在小麥大、小粒材料中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，RiG-SK2、RiGW8和RiGGC2可能為控制小麥大粒形成的基因，其在3份大粒材料中的表達(dá)量顯著高于小粒材料紅禿頭3：RiGSK2、RiGW8在HR2015-1-1-2-9中的表達(dá)量顯著高于其他兩份大粒材料和3份小粒材料。這可為小麥高產(chǎn)育種提供重要的基因資源，今后可將其用于小麥的高產(chǎn)育種。

3.2 控制籽粒大小的小麥同源基因在小粒材料中的作用

Hong等利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，降低了調(diào)控小粒形成的TaGV2A、TaGW2B、TaGV2D基因的轉(zhuǎn)錄水平，使得小麥粒寬、粒重增加。Wang等[28]利用CRISPR/Cas924產(chǎn)生OsOTUB1敲除突變體，使得水稻穗粒數(shù)和千粒重增加，從而提高了籽粒產(chǎn)量。Zhao等驗證發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻OsGSK2的RNAi系（OsGSK2-Gi-2）使得水稻籽粒長度增加了22%。可見，挖掘調(diào)控小粒形成基因，通過基因編輯干擾其表達(dá)可以提高作物產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，RiGS3、ArTTG2、RiD11基因可能與小麥小粒形成有關(guān)。其中ArTTG2在3份小粒材料中的表達(dá)量均顯著高于3份大粒材料：RiGS3、RiD11在紅禿頭3中的表達(dá)量顯著高于3份大粒材料，與其他兩份小粒材料紅穗及白穗白之間也存在顯著差異。因此可通過基因編輯技術(shù)將小粒形成基因RiGS3、ArTTG2和RiD11用于小麥高產(chǎn)育種，實現(xiàn)小麥增產(chǎn)。

綜上，本研究利用控制水稻和擬南芥大小籽粒發(fā)育的基因，從小麥基因組中鑒定出同源基因，并利用qRT-PCR法分析了各籽粒大小相關(guān)基因在不同大粒和小粒材料中的表達(dá)差異，初步篩選到可能控制大粒發(fā)育的基因RiGSK2、RiGW8和RiGGC2以及控制小粒發(fā)育的基因RiGS3、ArT-TG2、RiD11，為進(jìn)一步驗證其功能及調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)，同時可為小麥高產(chǎn)分子育種提供重要的基因資源。

基金項目：山東省自然科學(xué)基金項目（ZR202IQC198，ZR2020MC098）；山東省重點研發(fā)計劃項目（2022LZG002）