花生PLT基因家族全基因組鑒定與表達分析

摘要：PLT家族是植物特有的一類轉錄因子，在植物胚胎、干細胞、分生組織及器官生長發育等過程都起著重要作用。本研究利用生物信息學技術在栽培種花生基因組中鑒定到12個PLT家族基因，分布在11條染色體上：AhPLT蛋白大多含有2個保守的AP2結構域，編碼439 - 713個氨基酸，預測定位在細胞核或葉綠體中；AhPLT基因結構復雜，具有多樣的短外顯子結構，外顯子數在5-8個之間，不同家族成員中分布不同的保守基序：AhPLT家族成員啟動子區存在生長素、赤霉素和茉莉酸等激素相關的順式作用元件。qRT-PCR結果顯示，AhPLT1 -B和AhPLT5-B分別在根中和種子中的表達量最高：兩基因對激素IAA、6-BA和GA3有不同的響應，其中AhPLT1 -B受6-BA調控上調表達最顯著，AhPLT5-B受6-BA、IAA和GA，調控呈先升高后降低的表達模式。本研究為花生PLT基因的生物學功能研究提供了參考。

關鍵詞：花生：PLT轉錄因子：基因家族：生物信息學分析：表達分析

中圖分類號：S565.2：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0001-09

PLETHORA（PLT）屬于APETALA 2/ETHYL-ENE RESPONSE FACTOR（AP2/ERF）型轉錄因子，PLT家族成員在植物的新生分生組織中表達水平較高，參與新生分生組織的形成和維持以及器官的啟動和發育過程。PLT基因的結構包括兩個保守的AP2重復結構域，兩者之間存在較大的結構差異。

PLT在根發育過程中扮演重要角色，在促進根尖分生組織（root meristem，RM）的形態建成和活性維持，特別是靜止中心（quiescent center，QC）的定位中至關重要。QC在根尖分生組織中充當干細胞維持所需的組織中心。PLT1和PLT2被認為是維持根尖干細胞和QC細胞的胚胎規格所必需的兩個功能冗余基因，QC的形成要求PLTI-PLT2和SHR-SCR共同參與。PLT對于促進植物芽再生過程也具有重要作用。研究表明，PLT3、PLT5和PLT7通過復雜的機制調控擬南芥（Arabidopsis thaliana L．）芽再生的過程。具體而言，在芽從頭再生途徑中，側器官邊界相關基因CUC2發揮著關鍵作用，而PLT則通過調節CUC2的表達水平來促進芽的再生。另外，PLT還需要與CUC基因相互作用，以參與芽的再生調控過程。豆科植物的根瘤中寄居著固氮根瘤菌，這些根瘤形成在根部表示可能存在著與根相關的因素。研究發現，苜蓿（Medicago truncatula L.）中4個MtPLT基因在根結節發育和維持中起著冗余的功能作用，與擬南芥根部發育中的PLT基因相似。在干細胞的研究中，LT1和PLT2的啟動子活性以及蛋白結合物呈梯度狀分布，并在干細胞區域達到最大值。PLT活性很大程度上是累加性和劑量依賴性的，干細胞狀態受PLT活性水平的調控，高水平的活性有助于保持干細胞的原始狀態，較低水平的活性則促進干細胞有絲分裂，更低水平的PLT活性則會促進干細胞向分化狀態轉變。在根干細胞區域和不定芽生成過程中，可以觀察到PLT基因的特異表達。利用農桿菌侵染的方法，在金魚草（Antirrhinum majus L.）中侵染帶有PLT5基因的農桿菌可誘導不定芽的形成。用同樣的方法，在番茄（Solanum lyco-persicum L．）和兩個甘藍品種（Brassica rapa，var' Bok choy' and' Pei Tsai'）中侵染，都能獲得穩定遺傳的不定芽，表明應用PLT5可提高植物的轉化效率，并且這種轉化系統可促進基因組編輯或其他植物生物技術在現代農業中的應用。

花生（Arachis hypogaea L．）作為一種重要的油料和經濟作物，在我國具有廣泛的適應性和顯著的經濟效益等優點，總產量在油料作物中名列前茅。PLT基因家族在植物根、葉、花、根瘤等器官的生長發育，以及輔助遺傳轉化中發揮至關重要的作用。國內對PLT基因家族的研究相對較少，而且在花生領域幾乎沒有相關報道，因此對花生PLT基因家族進行研究具有重要的意義。花生遺傳轉化目前仍較困難，研究PLT基因家族將有助于開發新的花生轉化系統。本研究通過信息生物學手段對栽培種花生PLT基因家族成員進行全基因組鑒定和表達分析，為花生PLT基因家族功能研究以及花生再生體系建立奠定基礎。 1 材料與方法

1.1 花生PLT基因家族成員鑒定和染色體定位分析

借助Pfam數據庫（http：//pfam. xfam. org/）提供的PLETHORA（PF00847）結構域的隱馬爾可夫模型文件，利用TBtools軟件對花生數據庫進行搜索，接著運用CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih．gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）進行保守結構域鑒定和篩選。通過ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線網站分析花生PLT成員的氨基酸數量、蛋白質分子量、等電點、親水性以及亞細胞定位特征，利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ib-cp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page= npsa_sopma.html）在線網站對AhPLTs蛋白的二級結構進行詳細分析與結構預測。將PLT基因家族成員的基因名稱及其在染色體上的位置上傳至在線網站MG2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2. 11），對花生PLT基因在染色體上的定位進行分析。

1.2 花生PLT基因家族系統發育、基因結構及蛋白保守基序分析

為了研究PLT基因家族的進化關系，從Phy-tozome數據庫（https：//phytozome-next. jgi. doe.gov/）中下載花生、擬南芥、水稻（Oryza sativa L-）和苜蓿等物種的PLT基因序列和編碼蛋白氨基酸序列，利用TBtools軟件繪制系統進化樹，將輸出的nwk. file文件上傳至在線網站（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行美化。通過MEME在線網站（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對PLT蛋白序列進行保守基序motif分析，將保守基序數目設置為10;之后將花生PLT基因家族的gff3文件、保守基序分析結果（meme.XML）文件和進化樹分析結果（nwk.file）文件上傳至TBtools軟件對基因結構進行可視化分析。使用NCBI數據庫BLAST進行同源蛋白序列比對，選取跨物種同源蛋白序列，并將其導人ClustalX進行多序列比對。利用在線工具（https：//www.ebi.ac. uk/Tools/hmmer/）分析花生PLT蛋白的保守結構域，將數據上傳至TBtools軟件進行可視化分析。

1.3 花生PLT基因家族順式作用元件預測

通過分析AhPLTs起始密碼子上游2 000 bp序列，并參考Chao和Wang等的研究方法，預測順式作用元件。

1.4 花生PLT基因家族在不同組織部位的表達分析

為進一步了解PLT基因在花生不同組織中的表達情況，在Peanut Base（https：//peanutbase.org/）數據庫中下載參考基因組（arahyTifrunner.GnmI.Ann1. CCJH）的表達譜數據，從中篩選出PLT基因家族成員在19個花生組織中的表達數據，包括葉片、莖尖、根、根瘤、花被、雄蕊、雌蕊、莢果、果針、果殼和種子等。使用聯川生物云平臺站（https：//www.omicstudio.cn/tool/4）對花生PLT基因家族各個組織表達量歸一化（數值進行Log2處理），隨后構建基因表達熱圖。

1.5 花生PLT基因家族不同激素處理下表達模式分析

供試花生品種為農大花108，對成熟種子及萌發生長3周左右花生植株的根、莖、莖尖和葉片取樣：對萌發生長3周左右的幼苗分別噴施50μmol/L IAA、25 μmol/L 6-BA和100 μmol/L GA3進行激素處理，并在0（處理前）、1、3、6、12、24 h取植株葉片。每個試驗3次生物學重復，每個重復取3株的樣品混合。將所取材料裝入無RNA酶離心管中，液氮速凍后-80℃保存。

通過qRT-PCR檢測PLT基因在不同激素處理下的表達情況，引物信息見表1。根據TransS-cript@Green One - Step qRT - PCR SuperMix（TRANS）說明書進行qRT- PCR。反應體系（20μL）：Mix 10 μL，ddH20 8.2 μL，cDNA模版1 μL，上、下游引物各0.4 μL。反應程序：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，40個循環。內參基因使用actin，利用2-△△Ct方法計算AhPLT基因的相對表達水平，然后運用Graphpad Prism軟件進行數據可視化呈現，分析花生PLT基因在組織器官和不同激素處理下的表達情況。

2 結果與分析

2.1 花生PLT基因家族成員鑒定和染色體定位

本研究從花生全基因組中共鑒定到12個PLT基因家族成員，分別命名為AhPLTl -A、Ah-PLT1-B、AhPLT2 -A、AhPLT2 -B、AhPLT3 -A、Ah-PLT3-B、AhPLT4 -A、AhPLT4 -B、AhPLT5 -A、Ah-PLT5-B、AhPLT7 -A、AhPLT7 -B。編碼439 - 713個氨基酸，分子量在47.10 - 77.95kDa之間，等電點為5.74-8.46（表2）。AhPLT蛋白的亞細胞定位預測結果（表2）顯示，除AhPLT3-A和AhPLT3-B兩個蛋白定位于葉綠體外，其他蛋白均定位在細胞核中。花生PLT蛋白平均親水系數均為負值，說明這些蛋白均為親水性蛋白。

染色體定位結果（圖1）顯示，AhPLT成員的染色體分布并不均勻，12個AhPLT基因分布在花生的11條染色體上，但大部分染色體上只分布有1個基因，只有8號染色體上分布有2個基因。

2.2 花生PLT基因家族系統進化樹構建、基因結構及蛋白保守基序分析

將12個花生PLT蛋白與擬南芥、水稻、二倍體花生中的PLT蛋白進行系統發育分析。結果（圖2）表明，12個花生PLT蛋白在進化關系上分為4個分支。其中，AhPLTI-A、AhPLTl-B與At-PLTI/AIL3（AT3G20840.1）和AtPLT2/AIIA（ATIG51190.1）聚類到同一分支，AhPLT3 -A、Ah-PLT3-B與AtPLT3/AIL6（AT5G10510.1）和At-PLT7（AT5G65510.1）聚類到同一分支，AhPLT4 -A、AhPLT4 -B與AtPLT4（AT5G17430.1）聚類到同一分支，AhPLT5 -A、AhPLT5 -B與AtPLT5（AT5 G57390.1）聚類到同一分支，表明它們之間存在密切的親緣關系。

基因結構分析結果（圖3A）表明，PLT的結構復雜且具有多樣的短外顯子結構，外顯子數介于5-8個之間。其中，AhPLT3 -A、AhPLT3-B、AhPLT7-A和AhPLT7-B外顯子數目最多，各有8個，AhPLT2 -A和AhPLT4-B的外顯子數目最少，各有5個。

通過MEME在AhPLT家族中檢索到10個保守motif（圖3B），其中Motif 1、Motif 2、Motif 6和Motif 7在12個成員中均存在：只有AhPLT2-B缺失Motif 5；AhPLT2-A和AhPLT2-B缺失Motif 3和Motif 4；除AhPLT5 -A、AhPLT5 -B、AhPLT7-A和AhPLT7-B外，其他成員均有Motif 10。值得注意的是Motif 7位于AhPLT5-A和AhPLT5 -B的C端，而在家族其他成員中均位于N端，這是兩者區別于家族中其他成員的結構。結果表明，在AhPLT進化過程中家族成員的蛋白序列相對保守。

花生PLT家族成員的蛋白保守結構域分析結果（圖3C）顯示，AhPLT蛋白含有AP2和AP2superfamily等結構域，其中所有成員均含有AP2結構域，只有AhPLT3-A、AhPLT3-B、AhPLT5 -B、AhPLT7 -A含有AP2 superfamily。多序列比對結果顯示，該家族蛋白的結構特點主要表現為包含兩個具有高度保守性的AP2結構域，分別命名為R1和R2，其中，AhPLT2 -A、AhPLT2 -B和Ah-PLT4-B蛋白的R2結構域缺失。

2.3 花生PLT基因家族順式作用元件

通過對AhPLT基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp序列進行分析，發現其中不僅含有光響應和逆境響應等元件，還擁有植物激素應答相關的元件。PLT基因在調節植物器官的生長發育過程中，通過響應各種植物激素發揮作用。選取生長素（TGA - element，AACGAC）、水楊酸（TCA-element，CCATCTTTTT）、茉莉酸（TGACG - motif，TGACG）、脫落酸（ABRE，ACGTG）、種子特異性（RY-element，CATGCATG）、光響應（MRE，AAC-CTAA）和赤霉素（P-box，CCTTTTG）7類順式作用元件進行分析，結果（圖4）發現，AhPLT基因家族成員啟動子區域包含的ABA響應元件最多，僅在AhPLT4-B和AhPLT7-A上未預測到：赤霉素元件在大多數成員中也都可以預測到，而生長素相關元件僅存在于AhPLT1 -A、AhPLT3 -A和Ah-PLT3 -B上。種子特異性元件只有AhPLT1和Ah-PLT5啟動子包含，表明這兩個基因可能參與花生種子發育的調控過程。

2.4 花生PLT基因家族組織特異性表達分析

為了探究PLT家族基因在花生不同組織部位的表達差異，在花生數據庫Peanutbase中下載花生參考基因組表達譜數據，從中篩選出PLT基因家族成員在19個花生組織中的表達譜數據。繪制熱圖后結果（圖5）顯示，12個AhPLT基因的表達模式表現出明顯的組織特異性。AhPLT1、AhPLT2和AhPLT4在根和種子發育的早期有較高的表達水平，推測它們可能與花生根和種子的發育相關。AhPLT5同樣可能參與花生種子的發育過程，但其可能主要在種子發育的后期發揮作用。AhPLT3 -B在雄蕊中的表達量最高，推測其可能參與花生雄蕊或花粉發育的調控過程。Ah-PLT7在主莖莖尖和側枝莖尖的表達量較高，表明其可能參與花生頂端分生組織活性的調控過程。

2.5 花生PLT1和PLT5基因在不同激素處理下表達模式分析

基于PLT1和PLT5基因的重要功能，本研究利用qRT-PCR檢測了AhPLTl -B和AhPLT5-B在花生不同組織部位和和3種激素處理下的表達模式。結果表明，AhPLTl -B在莖、莖尖、葉和種子中表達量較低，在根中表達量最高；AhPLT5 -B在種子中的表達量最高（圖6A）。在IAA處理下，花生葉片中AhPLT1 -B的表達量隨處理時間的延長呈現明顯上調趨勢，AhPLT5 -B表達量在處理1 h達到最大值，之后逐漸下降（圖6B）；經過6-BA處理后，AhPLTl -B和AhPLT5-B都有不同程度的上調，從3h開始AhPLT1 -B的表達量升高，24 h達到最高，AhPLT5-B表達量6h達到最大值，之后有所下降（圖6C）；在GA，處理下，Ah-PLTl -B和AhPLT5-B的表達模式類似，表達量都在6h達到最大值，隨處理時間延長，表達量開始出現下降趨勢（圖6D）。AhPL T1 -B和AhPLT5 -B對IAA、6-BA和GA，都有不同程度的響應，其中對6-BA的響應最明顯，表明6-BA在兩基因發揮功能時起著重要作用。

3 討論與結論

AP2/ERF作為一類獨特的轉錄因子，在植物中發揮著重要作用。PLT基因家族作為其中的重要成員，在調控植物胚胎發育、維護分生組織以及促進器官生長等過程中扮演關鍵角色。在本研究中，通過對栽培種花生全基因組進行深入鑒定，成功篩選出12個PLT基因，同時，結合幾種模式植物如擬南芥、水稻等的進化分析，對其進行了命名，揭示PLT基因在植物界的分子進化過程。擬南芥中PLT5參與調控不定芽的生長發育，在番茄中過表達PLT5也可以促進創傷處長出新的愈傷和不定芽。進化分析結果表明，花生AhPLT5-A、AhPLT5 -B與AtPLT5具有較近的親緣關系，因此推測AhPLT5 -A和AhPLT5-B為AtPLT5的直系同源基因，且也具有促進愈傷組織和不定芽再生的功能。

PLT基因家族含有2個保守的AP2結構域，基因結構比較復雜，外顯子數量較多。對花生PLT基因結構進行分析發現，其外顯子數量為5-8個，與擬南芥、水稻等模式植物基本一致，說明不同物種中PLT基因家族在進化過程中相對保守。保守結構域分析和AP2結構域多序列比對分析也表現出相似的結果。

PLT基因家族成員參與植物花、芽、結節以及根等組織和器官的發育過程。本研究使用19個花生組織的表達數據對12個AhPLT基因表達模式進行分析，發現大部分基因表達量比較低，個別基因在根、莖尖和種子中的表達量相對較高，推測PLT家族成員在這些花生器官的生長發育過程中發揮重要作用。PLT1和PLT5在愈傷組織和不定芽的生長過程中起著重要的作用，利用PLT5進行遺傳轉化還能夠提高轉化效率。AhPLT1和AhPLT5的啟動子上包含響應生長素和細胞分裂素等激素的調控元件，說明它們可能通過響應這些激素信號誘導參與調控植物的生長發育過程。已有的研究表明，PLT5在芽原基起始和活性維持中起重要作用，而PLT1作為核心模塊調控根尖的發育。組織特異性表達分析的結果表明，這兩個基因可能還參與了花生種子的發育調控過程進而影響花生的產量。對花生進行不同激素處理后，兩個PLT基因對激素IAA、6-BA和GA。都有不同程度的響應，其中AhPLT1 -B受6-BA調控上調表達最顯著，AhPLT5 -B受6-BA、IAA和GA，調控呈先升高后降低的表達模式。同時，研究發現應用PLT1和PLT5可以提高愈傷組織和不定芽的再生效率，具有提高花生遺傳轉化效率的應用潛力。

綜上所述，本研究在栽培種花生中鑒定到了12個AhPLT基因，并對PLT家族成員進行了詳細的特征分析與進化分類，結合AhPLT基因表達數據，對基因在不同激素處理下表達模式進行了分析，篩選出AhPLT1和AhPLT5兩個與花生再生相關的候選基因，并發現細胞分裂素6-BA可能參與了對它們功能的調控。以上結果表明，AhPLT基因可能在花生的生長發育和再生過程中具有重要作用，但其調控機制仍需進一步探討。

基金項目：河南省重大科技專項（221100110300）；河南省重點研發專項（221111110500）；河南省產業技術體系專項（HARS-22-05- G1）