基于新型發夾核酸探針和G-四鏈體/血紅素脫氧核酶的多功能生物傳感器

摘要 以發夾核酸探針（HP）為識別元件，基于靶介導的DNA構象轉換，構建了一種用于檢測血紅素和血紅蛋白的熒光“turn-on”模式的生物傳感器。以游離HP 為分子信標探針，供體與受體之間可發生高效熒光共振能量轉移，導致熒光猝滅；當探針的富G序列在血紅素誘導下形成穩定的G-四鏈體/血紅素復合物時，供體與受體之間的距離拉大，熒光信號恢復。熒光法對血紅素和血紅蛋白的檢出限分別為283 和109 pmol/L。進一步，基于G-四鏈體/血紅素復合物的類過氧化物酶活性以及L-半胱氨酸對酶活性的抑制，實現了對L-半胱氨酸的可視化分析，檢出限為3.6 μmol/L，低于細胞內半胱氨酸的正常水平（30～200 μmol/L）。這種多功能生物傳感平臺具有檢測快速、簡便和靈敏的優點，在生物分析、藥物篩選和疾病診斷等領域具有潛在的應用價值。

關鍵詞 G-四鏈體；脫氧核酶；血紅素；血紅蛋白；生物傳感器

脫氧核酶（DNAzyme）是20 世紀90 年代發現的一類具有靶標識別能力和催化功能的單鏈DNA 分子。迄今為止，已發現十余種不同功能的DNAzyme。其中， 8-17 DNAzyme 是研究最多的脫氧核酶，與10-23 DNAzyme 都具有識別并切割RNA 的功能[1]；Cu2+依賴性DNAzyme 具有切割DNA 底物的功能[2]；E47 DNAzyme 可催化DNA 之間的連接反應[3]；G-四鏈體/血紅素DNAzyme 具有類過氧化物酶活性，可催化底物顯色或發光反應[4-5]；UV1C DNAzyme 具有類似光解酶的活性，可使胸腺嘧啶二聚體發生解聚[6]。在這些功能各異的DNAzymes 中， G-四鏈體/血紅素DNAzyme 因具有良好的穩定性、較高的特異性和酶活性而備受關注。G-四鏈體是G-四鏈體/血紅素DNAzyme 的關鍵組成部分，在K+或Na+誘導下，富含鳥嘌呤（Guanine， G）的DNA 序列可形成G-四鏈體結構，進而與血紅素結合形成具有酶活性的G-四鏈體/血紅素DNAzyme。其中， G-四鏈體是由多個G4 片層通過堿基之間的π-π堆積作用構成；G4片層可由富含串聯重復G 序列的DNA 構成，根據DNA 鏈的長短不同，可形成分子內或分子間的G4 片層[7]。近年來， G-四鏈體/血紅素DNAzyme 已在生物傳感、生物成像和疾病診療等領域得到廣泛研究和應用[8-11]。

血紅素是一種天然的鐵卟啉化合物，作為血紅蛋白的輔基，對人體血液中氧氣的運輸具有重要作用。血紅素也是肌紅蛋白、細胞色素和過氧化物酶、過氧化氫酶等的輔基，參與細胞的電子傳遞和能量產生等多種生物化學反應。此外，血紅素也是臨床重要的補鐵藥物之一。因此，對血紅素的準確定性和定量分析對疾病診斷與治療、生物藥物的研發等具有重要意義。目前，已報道了多種血紅素的分析方法，包括分光光度法[12-13]、化學發光法[14]和電化學法[15]等。其中，熒光分光光度法靈敏度高、操作簡便、檢測時間短，已得到普遍認可和應用。目前，對血紅素的熒光檢測主要基于兩種機制：利用血紅素對發光納米材料熒光的特異性猝滅機制，以及利用各種核酸探針與血紅素之間的特異性結合機制。研究者分別報道了具有熒光發射特性的石墨相氮化碳納米片[12]、碳納米點[16]和金納米團簇[17]，利用靶分子介導的熒光猝滅，實現了血紅素的簡便、快速檢測，檢出限分別為0.15、0.25 和0.43 nmol/L。這些方法特異性強、選擇性高，但靈敏度尚顯不足；另外，“turn-off”模式的熒光檢測具有一定的局限性。與人工合成納米材料相比， DNA 作為一種被廣泛使用的納米生物材料，具有可精確合成、穩定性好、容易標記等優點，而且DNAzyme具有較高的催化活性，可實現血紅素的靈敏檢測，因而在多個領域均顯示出良好的實用性[13，18]。

血紅蛋白（Hemoglobin， Hb）是生物體內紅細胞的重要組成部分，主要負責氧氣的攜帶和運輸，血紅素輔基是血紅蛋白能夠攜氧的關鍵。血紅蛋白濃度異常會導致某些疾病發生，例如貧血和白血病與血紅蛋白濃度降低有關，而心血管病和糖尿病與糖化血紅蛋白水平升高有關[19-22]，因此，對人體內血紅蛋白濃度的監測具有重要意義。臨床上使用最廣泛的血紅蛋白檢測方法為比色法，需要將血紅蛋白轉變為穩定的血紅蛋白衍生物再進行檢測。近年報道的一些新方法，如電化學方法[23-24]、表面等離子體共振[25-26]和熒光法[27-30]等，具有較高的選擇性、靈敏度和實用性。上述方法的不足之處在于不能直接對血紅蛋白進行檢測[30]，需要用蛋白酶水解釋放出血紅素輔基，增加了檢測成本；而基于熒光猝滅機制的方法容易受到溫度和pH 值等因素的影響[31-32]。因此，迫切需要開發響應快、準確度高、成本低、操作簡便的血紅蛋白檢測新方法。

半胱氨酸（L-Cys）是一種重要的含巰基的氨基酸，參與多種含硫化合物的生物合成，與細胞內的新陳代謝過程密切相關。L-Cys 還參與蛋白質的折疊、半胱氨酸蛋白酶的催化以及生理信號的轉導等過程。L-半胱氨酸水平異常會引起一系列生理疾病，如生長遲緩、毛發褪色、肝臟損傷、關節炎和阿爾茨海默病等[33-35]。因此，開發高效檢測L-Cys 的新方法具有重要的臨床意義。目前，用于檢測L-半胱氨酸的方法主要有光譜法[36-37]、毛細管電泳法[38]、高效液相色譜法[39]和電化學發光法[40]等。然而，這些方法需要昂貴的設備，操作復雜，樣品制備過程較繁瑣，普適性不佳。近年來，研究者報道了多種具有類過氧化物酶活性的納米材料，如碳納米點[36]、金屬@金屬氧化物納米籠[41]、金屬氧化物填充聚吡咯納米管[42]和氧化鈷納米管[38]等，為L-Cys的檢測提供了新思路。

本研究利用富G 發夾核酸探針，構建了一種簡便、快速和高靈敏的光學方法用于血紅素和血紅蛋白的檢測。紫外-可見吸收光譜分析結果表明，此核酸探針與血紅素之間發生了特異性相互作用。基于此，利用G-四鏈體/血紅素DNAzyme 的類過氧化物酶活性，成功實現了L-Cys 的快速比色檢測。